两个胞外受体蛋白的克隆与黄萎病抗性分析

论文摘要

黄萎病是一类土传维管束真菌病害，可导致棉花的品质降低，产量大幅减少甚至绝收。目前对于黄萎病虽然进行了大量研究，但仍未找到可以根治的办法，主要是由于黄萎病病原菌的致病机制颇为复杂以及抗病种质资源较匮乏。一直以来，转基因抗病育种都被认为是解决植物病害的有效途径，因此，黄萎病抗性基因的克隆便成为当前棉花抗黄萎病育种的研究热点。Ve1是来源于番茄黄萎病抗性品种VFN8的一个表面受体蛋白基因，对黄萎病菌生理小种1具有抗性。本实验根据Ve1基因序列从番茄抗性材料中获得该基因，并构建到由组成型强启动子CaMV35S控制的植物过量表达载体pCAMBIA2301上，通过农杆菌介导法将其转入模式植物拟南芥中。经卡那霉素抗性筛选与分子检测，得到转基因拟南芥T0代5个植株。对转基因拟南芥T1代株系进行了PCR和抗病性鉴定。结果表明，转Ve1基因拟南芥株系对棉花落叶型黄萎病原菌V991可延缓发病，对Bp2的抗性与未转基因拟南芥对比并无显著增强。本实验通过RT-PCR和Genomewalking发现并获取了一个全新的RLP类黄萎病抗性基因GhVdr2，该基因来源于高抗落叶型黄萎病的陆地棉品种常抗棉（Gossypiumhirsutum L.）。GhVdr2基因全长为3417bp，编码1139aa。尽管GhVdr2基因与Ve1、Ve2的相似性只有50%，但它与LRR-TM类抗病基因结构类似，同样含有LRR重复单元和跨膜区。GhVdr2具有11个LRR保守结构域，在N端和C端各有1个跨膜结构域。该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的诱导后上调表达。将GhVdr2与CaMV35S启动子构建植物表达载体转化拟南芥哥伦比亚型植株并接种黄萎病原菌，野生型拟南芥对照接种15天后叶片明显萎蔫黄化，植物生长迟缓，而转化株虽也出现一定症状，但仍可正常结实。抗病性鉴定结果显示该基因过量表达可以显著提高拟南芥对落叶和非落叶型黄萎病强致病力菌株V991和Bp2的抗性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 1、文献综述
• 1.1 棉花黄萎病研究现状
• 1.1.1 棉花黄萎病的症状
• 1.1.2 棉花黄萎病病原菌
• 1.1.2.1 黄萎病菌的生物学特性
• 1.1.2.2 黄萎病菌的生理分化
• 1.1.2.3 黄萎病菌的致病机制
• 1.1.3 植物对黄萎病的抗性机制
• 1.1.4 植物对黄萎病的抗性遗传
• 1.1.5 抗黄萎病棉花的育种工作
• 1.2 植物抗黄萎病基因的研究进展
• 1.2.1 植物抗病基因的类型
• 1.2.1.1 LRR-TM 类抗病基因
• 1.2.1.2 番茄抗黄萎病菌 Ve 基因
• 1.2.2 植物抗病基因的作用机制
• 1.2.3 转基因获得黄萎病抗性材料研究进展
• 2、引言
• 3、材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 实验材料总DNA与RNA的提取
• 3.2.2 Ve1基因的PCR扩增
• 3.2.3 Ve1扩增产物的克隆与鉴定
• 3.2.4 Ve1基因植物过量表达载体的构建
• 3.2.5 Ve1基因转化农杆菌及单克隆鉴定
• 3.2.6 Ve1基因转化拟南芥及转基因植株鉴定
• 3.2.7 转Ve1基因拟南芥植株的抗病性鉴定
• 3.2.8 棉花GhVrd2基因的扩增
• 3.2.9 GhVdr2扩增产物的克隆与鉴定
• 3.2.10 GhVrd2基因植物过量表达载体的构建
• 3.2.11 GhVdr2转化农杆菌及单克隆鉴定
• 3.2.12 GhVdr2转化拟南芥及转基因植株筛选
• 3.2.13 GhVdr2基因在棉花不同器官中的表达量分析
• 3.2.14 棉花GhVdr2基因的诱导表达分析
• 3.2.15 转GhVdr2拟南芥植株的抗病性鉴定
• 4、结果与分析
• 4.1 番茄Ve1基因的克隆及抗病性鉴定
• 4.1.1 Ve1 基因的克隆
• 4.1.2 Ve1 基因植物表达载体的构建与鉴定
• 4.1.3 Ve1 基因植物表达载体转化农杆菌
• 4.1.4 拟南芥转 Ve1 基因植株的获得与鉴定
• 4.1.5 拟南芥转Ve1基因植株的抗病性鉴定
• 4.2 棉花 GhVdr2 基因的克隆及抗病性鉴定
• 4.2.1 GhVdr2基因的扩增与克隆
• 4.2.2 GhVdr2基因植物表达载体的构建与鉴定
• 4.2.3 GhVdr2基因植物表达载体转化农杆菌
• 4.2.4 拟南芥转GhVdr2基因植株的获得与鉴定
• 4.2.5 GhVdr2基因在棉花不同器官中的表达量结果分析
• 4.2.6 棉花GhVdr2基因不同诱导表达的结果分析
• 4.2.7 转GhVdr2基因拟南芥的黄萎病抗性鉴定
• 5、讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读学位期间的学术成果