东南景天镉抗性相关功能基因筛选体系构建

论文摘要

恶劣的环境条件，如干旱、低温、土壤盐渍化、重金属污染是对植物的生长和生存最具挑战性的因素。植物对逆境的适应需要代谢、细胞生长、分裂和分化的协同改变，依赖于一个需要大量基因共同作用的复杂的调控机制。通过重金属、盐、寒冷或干旱胁迫上调表达基因的差异显示方法鉴定了一些抗逆相关基因和胁迫信号调控因子，但事实上，大多数控制重金属、高盐、干旱和寒冷响应的功能基因是通过突变群体的正向遗传学筛选方法获得的。本研究构建了由CaMV35S启动子调控的表达框两侧翼带有Sfi I克隆位点（Sfi IA，Sfi I B）、并携带有basta筛选标记的的植物表达载体pBI121GB。以筛选出的镉超积累矿山型东南景天（Sedum alfredii）为材料，经镉胁迫后提取总RNA，纯化mRNA，利用改良SMART技术合成了全长cDNA，回收500bp以上cDNA片段克隆到改造过的植物表达载体pBI121GB中，建成东南景天镉胁迫全长cDNA过表达文库（FOX），对随机挑取的阳性克隆进行PCR鉴定，插入片段大小约为1000bp，说明所构建的文库达到了用于目的基因分离筛选和表达的要求，为筛选克隆与东南景天耐重金属相关基因奠定了基础。将连接有东南景天全长cDNA文库的载体转化农杆菌后，借助于初步建立的农杆菌介导的拟南芥浸花转化体系，获得转基因植株。经过对拟南芥突变株的PCR鉴定及RT-PCR等分子生物学检测，结果表明东南景天cDNA已经转移到了拟南芥基因组中并得到超量表达，证明了本研究所探索的技术体系是可行的。由于时间关系，目前我们仅建立了拥有1000个株系的东南景天cDNA转拟南芥突变体库，高效转化并用basta大规模筛选以及耐镉性分析工作仍在进行中。本文提供了一个鉴定在东南景天中参与镉胁迫调控功能的基因的方法，包括将东南景天全长cDNA文库高效连接到一个植物超表达载体，使文库中的cDNA能够在植物过量表达；并将该表达文库引入野生型拟南芥中，产生包含插入片段cDNA的转基因植物；检测转基因植物的表型及对镉胁迫的生理响应；克隆候选转基因植物所携带的目的基因并验证其功能。本研究证实了FOX系统在植物基因大规模鉴定中的有效性，作为一种新的高通量的基因挖掘系统，在植物功能基因组学研究和遗传改良方面具有广阔的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 镉耐受机制的国内外研究进展
• 1.2 植物功能基因组学研究现状及研究策略
• 1.3 植物耐受或积累重金属相关基因
• 1.3.1 转运蛋白
• 1.3.2 螯合蛋白
• 1.4 铁蛋白在植物逆境响应中的作用
• 1.4.1 铁蛋白是一种普遍存在的逆境响应蛋白
• 1.4.2 铁蛋白与生物胁迫
• 1.4.3 铁蛋白与非生物胁迫
• 1.5 研究内容及技术路线
• 第二章 东南景天全长 cDNA 文库构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 mRNA 提取结果分析
• 2.2.2 全长 cDNA 合成与分级分离
• 2.2.3 文库的转化和鉴定
• 2.3 小结
• 第三章 适于东南景天功能基因研究的 FOX 载体构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1. PCR 定点突变引物设计与 PCR 扩增
• 3.2.2 PCR 扩增片段测序与序列比对分析
• 3.2.3 pBI121/trfA 中 sfi I 酶切位点消除
• 3.2.4 pBI121 表达单元中 sfi I 酶切位点的引入
• 3.2.5 pBI121 载体 BAR 基因的添加
• 3.3 小结
• 第四章 东南景天全长 cDNA 过量表达文库转化拟南芥的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 cDNA 表达文库的构建及检测
• 4.2.2 农杆菌的电击转化检测
• 4.2.3 拟南芥的遗传转化
• 4.2.4 转基因植株的分析
• 4.3 小结
• 第五章 结论与讨论
• 5.1 结论
• 5.1.1 适合于高通量筛选的过表达载体的构建
• 5.1.2 东南景天全长 cDNA 超量表达文库构建技术的建立
• 5.1.3 转基因植株的筛选及基因分离
• 5.2 讨论
• 5.3 展望
• 参考文献
• 在读期间的学术研究
• 致谢
• 摘要