对Leifsonia xyli subsp.cynodontis pLXC100质粒主动分配机制ParB蛋白的研究

论文摘要

基因组能够被平等分配到子细胞中是保证遗传物质稳定传代的条件之一。在真核细胞中，基因的分配过程已经研究较为清楚，但是人们对原核细胞的质粒和染色体分配过程仍知之甚少。目前已发现原核细胞的质粒和染色体编码两个反式作用蛋白和一个顺式作用位点参与质粒和染色体的分配过程，这种分配方式称为主动分配机制（active partition mechanism）。两个反式作用蛋白中一个蛋白是典型的ATP酶，具有ATP酶活性；另一个蛋白是DNA结合蛋白，能够结合到顺式作用位点，并与ATP酶共同作用形成分配复合物来介导分配过程。目前大多数研究主要针对革兰氏阴性菌，而对革兰氏阳性菌质粒主动分配机制研究较少。我们之前报道了革兰氏阳性菌Leifsonia xyli subsp．cynodontis天然质粒pLXC100的初步研究，这个质粒也存在两个蛋白（ParA、ParB）和一段DNA序列（parS）与主动分配相关，ParB是DNA结合蛋白，ParA是ATPase，并且活性受到ParB、pars的调节，三者可以形成复合物。这是在革兰氏阳性菌质粒中首次发现完整的主动分配元件。初步推测这种分配元件属于主动分配机制中的Ib类型。本研究以革兰氏阳性菌Leifsonia xyli subsp. cynodontis天然质粒pLXC100为材料，建立在前面的研究基础之上，应用多种生化技术对其分配元件ParB蛋白进行定性分析，展开对ParB蛋白性质的探索。此研究用IMPACT-TWIN蛋白纯化系统得到不含外源多肽标签的纯ParB蛋白，通过EMSA、DnaseI footprinting和SPR等技术，证实了ParB蛋白的DNA结合活性，得到结合DNA的动力学参数；基于二级结构的预测，克隆表达得到了五个突变体蛋白，应用EGS化学交联、HPLC和CD等方法，探讨了ParB蛋白结合DNA的氨基酸和二级结构，证实K70对ParB蛋白维持DNA结合活性是非常重要的。本研究对ParB蛋白的研究结果，丰富了革兰氏阳性菌Ib型主动分配机制的研究内容，推进了原核细胞质粒和染色体分离的研究进展。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 一、引言
• 1.1 质粒的主动分配机制简介
• 1.1.1 质粒主动分配机制基因元件组织方式
• 1.1.2 质粒主动分配机制的分类
• 1.1.3 质粒主动分配机制的调控与具体作用方式
• 1.1.4 质粒分配主动分配模型
• 1.2 Leifsonia xyli subsp.cynodotis天然质粒pLXC100的研究
• 1.2.1 pLXC100复制子的初步鉴定
• 1.2.2 pLXC100复制子的组成
• 1.2.3 pLXC100主动分配机制的初步推测:属于Ib型
• 1.3 pLXC100 ParB的初步研究
• 1.4 研究的意义
• 二、材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 酶和药品
• 2.1.2 主要实验仪器
• 2.1.3 菌株和质粒
• 2.1.4 引物
• 2.2 DNA序列分析和蛋白序列比对及二级结构预测
• 2.3 研究方法
• 2.3.1 含parB基因和其突变体基因克隆的构建
• 2.3.2 大肠杆菌感受态制备与转化
• 2.3.3 质粒的提取
• 2.3.4 重组质粒的PCR鉴定
• 2.3.5 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3.6 蛋白的表达纯化
• 2.3.7 考马斯亮蓝进行SDS—PAGE染色
• 2.3.8 SDS—PAGE胶蛋白的银染
• 2.3.9 90bpDNA的合成与电转回收
• 2.3.10 90bpDNA片段标记
• 2.3.11 凝胶阻滞实验
• 2.3.12 Dnase I footprinting实验
• 2.3.13 测序胶ladder制作
• 2.3.14 表面等离子共振（SPR）
• 2.3.15 EGS化学交联
• 2.3.16 高压液相色谱（HPLC）
• 2.3.17 圆二色光谱仪检测蛋白的二级结构
• 三、结果
• 3.1 ParB蛋白的二级结构预测:具有RHH（ribbon-helix-helix）结构
• 3.2 表达和纯化得到完整独立的ParB蛋白
• 3.3 ParB可以特异性地结合ParA基因上游的正向重复序列
• 3.4 得到ParB与90bp parS的结合的动力学参数
• 3.5 ParB在体外具有单体和二聚体两种存在形式
• 3.6 表达和纯化得到ParB蛋白N端和C端缺失突变体蛋白
• 3.7 ParB N端和C端缺失仍然具有DNA结合活性
• 3.8 表达和纯化得到ParB蛋白β-strand段三个突变体蛋白
• 3.9 ParB蛋白β-strand段第70位的赖氨酸具有重要作用
• 四、讨论
• 4.1 研究方法的讨论
• 4.1.1 用IMPACT-TWIN系统（New England Biolabs）表达和纯化蛋白
• 4.1.2 SPR（Surface Plasmon Resonance）技术的应用
• 4.2 实验结果的讨论
• 4.2.1 ParB蛋白的DNA结合活性
• 4.2.2 ParB蛋白在体外的两种存在形式
• 4.2.3 N端缺失和C端缺失对ParB蛋白性质的影响
• 4.2.4 氨基酸K70在ParB蛋白DNA结合活性方面的重要作用
• 五、展望
• 参考文献
• 硕士研究生在读期间发表及待发论文
• 致谢