论文摘要
目的:利用RT-PCR扩增弓形虫RH株依钙蛋白酶相关蛋白（calpain-related）基因的cDNA片段,通过RNA点杂交和Northern blot鉴定该虫体calpain-related mRNA分子大小;构建原核表达载体并表达重组蛋白,为弓形虫的疫苗研究提供后选分子。方法:通过感染BALB ?c小鼠收集刚地弓形虫速殖子,提取虫体总RNA;根据弓形虫网络数据库(（http://www.toxodb.org）提供的推测calpain-related mRNA序列设计PCR扩增引物,用RT-PCR技术扩增弓形虫calpain-related cDNA片段,所获得的cDNA片段植入pGEM-T载体,提取重组质粒,经SalⅠ和BamHⅠ双酶切法及测序鉴定cDNA序列;再经双酶切将该cDNA片段插入原核表达质粒pET32-a,重组表达载体经SalⅠ和BamHⅠ酶切及测序鉴定后,转化E. coli BL21感受态宿主菌,并以IPTG诱导表达calpain- related重组蛋白,用SDS-PAGE鉴定重组蛋白分子量及蛋白表达量。用calpain-related cDNA片段制备核酸杂交探针,用RNA点杂交（Dot-blot）和Northern blot观察该基因在弓形虫体内表达及calpain-related mRNA分子大小。结果:琼脂糖凝胶电泳分析表明所提取的弓形虫总RNA28SrRNA与18SrRNA的比值大于1,条带清楚。用calpain-related特异引物经RT-PCR扩增后获得弓形虫RH株calpain-related cDNA片段约500bp,与预期值相符。将该cDNA片段植入pGEM-T载体后经双酶切和测序鉴定,该cDNA片段长500bp, DNA序列与弓形虫网络数据库提供的推测calpain-related mRNA序列完全一致。所构建的pET32a?calpain-related表达载体经双酶切和测序鉴定表明表达载体框架和序列正确,该表达载体转化E. coli BL21宿主菌后在IPTG的诱导下可大量表达重组蛋白,所表达的重组蛋白分子量约26kD,与预期分子量相符。宿主菌所表达的重组蛋白经Ni-NTA琼脂糖亲和层析分离柱纯化后获得大量重组蛋白。RNA Dot-blot结果表明calpain-related基因在虫体内表达;Northern blot结果提示弓形虫calpain-related mRNA的大小约6800bp。结论:本研究成功克隆出弓形虫calpain-related cDNA片段,并成功构建pET32a-calpain-related重组表达载体,该表达载体可在E. coli BL21宿主菌中大量表达重组蛋白,该重组蛋白将用于弓形虫疫苗免疫注射实验。
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