番木瓜乳管特异表达启动子的克隆及功能分析

论文题目: 番木瓜乳管特异表达启动子的克隆及功能分析

论文类型: 博士论文

论文专业: 作物遗传育种

作者: 杨英军

导师: 周鹏

关键词: 番木瓜,启动子克隆,乳管特异表达,功能鉴定

文献来源: 华南热带农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 目前,启动子是国内外研究的一个热点,已发现了大量组织特异性启动子和诱导型启动子。热带果树番木瓜作为理想的生物反应器植物受体,在其乳管系统中表达外源蛋白具有易收获、易分离纯化等诸多优点,因此,分离番木瓜乳管特异表达的启动子具有重要意义。 本研究以我国优良的番木瓜品种“穗中红”为试验材料,利用染色体步移技术获得了番木瓜乳管中两种重要的蛋白酶proteinase omega基因和chymopapain基因的启动子区序列,并利用基因工程的原理和方法,构建了这两个基因启动子的缺失载体,分别采用基因枪轰击法和农杆菌介导的转化法将这些载体导入番木瓜的叶片和烟草中,进行了GUS基因的瞬时表达研究和稳定整合研究,以分析启动子各区段的功能,获得的主要结论如下: 1.经过三次染色体步移,从番木瓜品种“穗中红”基因组中克隆到了蛋白酶proteinase omega基因(登录号:X66060)的部分序列及其启动子区序列,片段全长1,505 bp,3′端长466 bp的片段与番木瓜的proteinase omega基因的5′端同源性为96%;5启动子区长度为1,039 bp,在数据库中没有搜索到同源区段,表明为第一次克隆得到。将全长序列递交GenBank数据库,登录号为AY695444。通过Promoterprediction软件对proteinase omega基因启动子区分析,结果表明在905 bp-955 bp和947 bp-997 bp的位置存在可能的基础启动子序列,其可能性分别为0.79和0.66,推测转录起始位点(即帽结构)为ATG前面的第50位的T或92位的A。进一步用PlantCARE软件对5′上游远端调控序列进行顺式作用元件分析,发现多种重要元件如TATA-box、CAAT-box、Atl-motif、HSE、I-box、ABRE、ERE、EIRE等。 2.利用染色体步移技术从“穗中红”基因组中分离到蛋白酶chymopapain基因(登录号:X97789)的部分序列及其5′侧翼区序列,片段全长719 bp,3′端长163bp的片段与番木瓜的chymopapain基因的5′端同源性为99%;5′侧翼区长度为556bp为启动子区,在数据库中没有搜索到同源区段,表明为第一次克隆得到。将全长719bp序列递交GenBank数据库,登录号为AY803756。用在线软件Promoter Prediction

论文目录:

中文摘要

英文摘要

文献综述

第一部分 番木瓜瓜乳蛋白及其相关酶类

1 概述

2 番木瓜的保健预防作用

2.1 增强机体免疫力

2.2 抗氧化、清除自由基作用

2.3 抗菌、抗病原体作用

2.4 营养补充作用

3 番木瓜瓜乳蛋白及其相关酶类

3.1 木瓜的主要化学成分

3.2 番木瓜瓜乳蛋白酶类

3.2.1 木瓜蛋白酶

3.2.2 木瓜凝乳蛋白酶

3.2.3 proteinase omega

3.2.4 甘氨酰内切酶

3.2.5 其他酶类

4 番木瓜做为生物反应器的研究

4.1 细胞培养获得蛋白酶类

4.2 转基因疫苗的开发

第二部分 启动子文献综述

1 启动子的概念、结构及其分类

1.1 启动子的概念

1.2 真核生物启动子的结构模型

1.3 启动子的分类

2 启动子克隆的意义及其克隆方法

2.1 启动子克隆的意义

2.2 启动子克隆的方法

2.2.1 利用启动子探针质粒载体筛选启动子

2.2.2 利用PCR技术克隆启动子

3 组织特异表达启动子

3.1 在营养器官中表达的组织特异型启动子

3.1.1 叶片特异表达启动子

3.1.2 韧皮部特异表达启动子

3.1.3 维管束特异表达启动子

3.1.4 块茎专一表达启动子

3.2 在生殖器官中表达的组织特异型启动子

3.2.1 花粉组织特异性启动子

3.2.2 果实特异表达启动子

3.2.3 花器官特异表达启动子

3.2.4 种子特异表达启动子

第三部分 番木瓜基因调控研究

本研究的目的意义

本研究的技术路线

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物材料和菌种

1.1.2 试剂和药品

1.1.3 主要仪器

1.2 方法

1.2.1 总DNA的提取、PCR引物的设计与合成

1.2.2 引物的设计与合成

1.2.3 基因组的酶切

1.2.4 与接头连接

1.2.5 PCR反应

1.2.6 PCR产物的回收

1.2.7 T-载体克隆与鉴定

1.2.8 宿主菌E.coli DH5α感受态细胞的制备

1.2.9 连接产物的转化

1.2.10 重组质粒的酶切鉴定

1.2.10.1 重组质粒的提取

1.2.10.2 质粒的纯化

1.2.10.3 重组质粒的酶切鉴定

1.3 序列的同源性搜索和顺式作用元件分析

1.4 启动子缺失表达载体的构建

1.4.1 Proteinase omega基因的启动子缺失表达载体的构建

1.4.1.1 启动子缺失片段的获得

1.4.1.2 启动子系列缺失产物与载体pCAMBIA1301的连接

1.4.2 Chymopapain基因启动子缺失载体构建

1.5 嵌合载体在番木瓜瓜乳中的瞬时表达研究

1.5.1 质粒的大量提取和纯化

1.5.2 瓜乳的收集与处理

1.5.3 嵌合载体在瓜乳中的瞬时表达研究

1.6 基因枪介导的遗传转化

1.6.1 材料的处理

1.6.2 微弹的制备

1.6.3 装弹轰击

1.6.4 GUS组织化学染色

1.7 重组农杆菌工程菌株的获得

1.7.1 农杆菌感受态的制备

1.7.2 农杆菌GV3101的转化(电激转化法)

1.7.3 筛选与鉴定

1.8 农杆菌介导的果实瞬时表达

1.9 农杆菌介导的烟草转化

1.9.1 烟草基因组DNA的制备

1.9.2 再生植株的PCR检测及GUS组织化学染色

2 结果与分析

2.1 基因组的酶切及启动子片段的克隆

2.1.1 基因组的酶切

2.1.2 番木瓜proteinase omega基因启动子的克隆

2.1.2.1 启动子序列分析

2.1.2.2 转录起始位点的预测和启动子元件的预测

2.1.3 番木瓜chymopapain基因启动子的克隆与分析

2.1.4 番木瓜papain基因启动子的克隆与分析

2.1.5 宝生物4B-300测序结果

2.1.6 克隆的两个启动子序列的同源性比对

2.2 表达载体的构建

2.2.1 Proteinase omega基因的启动子缺失载体的构建

2.2.2 番木瓜chymopapain基因启动子缺失载体的构建

2.2.3 嵌合载体在番木瓜瓜乳中的瞬时表达研究

2.2.4 不同长度的启动子驱动GUS基因在番木瓜叶片中的瞬时表达

2.2.5 农杆菌转化番木瓜果实研究

2.2.5.1 重组农杆菌的鉴定

2.2.5.2 农杆菌介导的GUS基因在番木瓜瓜乳和果实中的瞬时表达

2.2.6 乳管特异表达启动子嵌合载体在烟草中的稳定表达

2.2.6.1 转化烟草叶盘再生成株

2.2.6.2 再生植株的PCR分析

2.2.6.3 不同长度的启动子驱动GUS基因在烟草叶片中的稳定表达

2.2.6.4 启动子驱动GUS基因在烟草叶片中的伤诱导表达

3 讨论

3.1 启动子的克隆与功能鉴定

3.2 序列的生物信息学分析

3.3 载体的构建策略

3.4 关于番木瓜的乳管

3.5 番木瓜作为生物反应器的优势

3.6 下一步工作计划

4 结论

参考文献

论文图版

附录

致谢

发布时间: 2005-07-27

参考文献

• [1].中国野生葡萄芪合成酶基因表达调控研究[D]. 焦韵桐.西北农林科技大学2017

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