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靶向GLP-1及其受体的抗糖尿病新药研究以及肥胖性MSG小鼠特征及其发生高血糖的机制研究

2020-12-11阅读(219)

靶向GLP-1及其受体的抗糖尿病新药研究以及肥胖性MSG小鼠特征及其发生高血糖的机制研究

论文摘要

胰高血糖素样肽-1（Glucagon like-peptide-1, GLP-1）是20世纪80年代发现的一种肠降糖素,进食后由肠道L细胞分泌,经内分泌、神经及底物刺激等途径作用于各种胰岛细胞发挥多种功能,包括刺激胰岛素的生物合成和分泌,抑制胰高血糖素的分泌。GLP-1还具有抑制食欲,延缓胃排空,减少肝糖输出,增加胰岛素敏感性等作用。然而GLP-1最突出的优点是其降糖作用具有葡萄糖依赖性,不易引发低血糖；还能够促进胰岛β细胞增殖,抑制其发生凋亡。尽管如此,GLP-1分泌后很快被二肽基肽酶IV （DPPⅣ）降解,体内半衰期仅有2 min左右,很难应用于临床。由于GLP-1主要由其受体介导发挥作用,所以为了能更好地发挥GLP-1的各种抗糖尿病作用,研究者都在积极寻找能够抵抗DPPⅣ降解的长效GLP-1类多肽和GLP-1受体激动剂。本论文的主要研究目的是：1)评价一种新型GLP-1类多肽BPI3006的DPP IV和血浆稳定性以及对自发性2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM） KKAy小鼠血糖变化的控制效果；2)研究一种新型长效GLP-1受体激动剂E2HSA的抗糖尿病作用和作用机制；3)研究肥胖性MSG小鼠的特征及其发生高血糖的机制。第一部分新型GLP-1类似物BPI3006的抗糖尿病作用研究BP13006是一个采用化学合成方法将GLP-1 N端第2位肽键更换为新取代基团的GLP-1类多肽。DPPⅣ和血浆稳定性实验表明,BPI3006具有良好的DPPⅣ耐受性,但血浆稳定性较差。报告基因分析表明,BPI3006能够与GLP-1受体结合,促进cAMP生成,且作用强度与Exendin-4相当。体内实验结果显示,BPI3006单次给药能够显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的血糖,并具有良好的量效关系；能够降低自发性T2DM KKAy小鼠的空腹血糖。长期给予BPI3006,每天2次,能够明显改善KKAy小鼠的糖耐量异常状态和高胰岛素血症,明显减少其摄食量和饮水量,同时降低其体重。此外,BPI3006系列多肽BPI3007和BPI3008也能够显著降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的血糖,且作用时间较长。第二部分长效GLP-1受体激动剂E2HSA的抗糖尿病作用研究E2HSA是一种采用基因工程技术获得的Exendin-4串联多肽与人血清白蛋白的融合蛋白。E2HSA能够明显激活GLP-1受体,刺激cAMP生成,促进胰岛素基因表达。它不仅能够增加NIT-1细胞的活力,促进其增殖,还能够增强放线菌素D、佛波酯和水溶性胆固醇诱导其损伤后的细胞活力,减少放线菌素D和水溶性胆固醇诱导的凋亡发生率,明显增加胞内AKT和PDX-1蛋白的含量。E2HSA单次给药能够明显降低正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后的血糖,量效关系良好,作用时间至少为4天：能够减少正常ICR小鼠的摄食量,降低其体重,延缓其小肠蠕动,作用时间至少为3天。在四氧嘧啶小鼠中长期给予E2HSA能够明显降低其禁食和非禁食血糖,增加胰岛和血清胰岛素水平,减少摄食量和饮水量,降低体重。尽管如此,长期给予E2HSA能够明显诱导正常ICR小鼠和四氧嘧啶小鼠产生抗体,抗体滴度至少为1：1000000。第三部分肥胖性MSG小鼠特征及其发生高血糖的机制研究MSG小鼠的主要特征为向心性肥胖、胰岛素抵抗以及糖脂代谢紊乱,是一种典型的代谢综合症模型。本实验室在研究中发现,部分MSG小鼠空腹血糖明显升高,与糖尿病发病进程中由胰岛素抵抗状态下,胰岛代偿性分泌胰岛素使血糖维持在正常水平,至胰岛失代偿而出现高血糖的变化极为相似。因此,本文在比较研究MSG小鼠特征的同时,试图从中找出其发生高血糖的原因。生化测定结果显示,MSG小鼠胰腺和肝脏组织中超氧化物歧化酶（SOD）含量减少,甘油三酯（TG）含量增加,高密度胆固醇（HDL）含量降低。与MSG小鼠相比,高血糖MSG小鼠胰腺和肝脏中TG含量明显增加。免疫组织化学分析表明,MSG小鼠胰岛代偿性肥大,胰岛a细胞和p细胞之间的分布平衡被打破,胰岛素和胰高血糖素含量失衡；高血糖MSG小鼠胰岛萎缩,形状不规则,并且与MSG小鼠相比,胰岛素含量明显减少,胰高血糖素含量增加。基因表达结果显示,MSG小鼠胰腺组织中与p细胞增殖、凋亡、内质网应激、炎症损伤和免疫调节相关的因子,肝脏组织中炎症因子、免疫调节因子和炎症通路中NF-KB和JNK,以及脂肪组织中瘦素、炎症因子和免疫调节因子的基因表达都有不同程度地变化。与MSG小鼠相比,高血糖MSG小鼠胰腺组织中MafA基因表达的下调,CHOP、IL-6、BAX和BAK基因表达的上调,以及脂肪组织中瘦素和TNFa基因表达的上调可能是导致其发生高血糖的原因。双向电泳结果显示MSG小鼠肝脏和胰腺组织内有多种蛋白表达发生变化,与MSG小鼠相比,高血糖MSG小鼠中的差异表达蛋白可能与其发生高血糖有关,但尚需进行蛋白归属。

论文目录

  • 缩略词表
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 新型GLP-1类似物BPI3006的抗糖尿病作用研究
  • 前言
  • 第一节 BPI3006的稳定性考察
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 1. BPI3006对DPP Ⅳ降解的耐受性
  • 2. BPI3006在人血浆中的稳定性
  • 实验小结
  • 第二节 BPI3006对RIP1-6×CRE报告基因表达的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • BPI3006对RIP1-6×CRE报告基因表达的影响
  • 实验小结
  • 第三节 BPI3006对正常ICR小鼠血糖变化的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 1. BPI3006单次给药对正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后血糖变化的影响
  • 2. BPI3006单次给药对正常ICR小鼠空腹血糖变化的影响
  • 实验小结
  • y小鼠血糖控制的影响'>第四节 BPI3006对自发性KKAy小鼠血糖控制的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • y小鼠空腹血糖变化的影响'>1. BPI3006单次给药对KKAy小鼠空腹血糖变化的影响
  • y小鼠24-h血糖变化的影响'>2. BPI3006长期给药对KKAy小鼠24-h血糖变化的影响
  • y小鼠口服葡萄糖耐量的影响'>3. BPI3006长期给药对KKAy小鼠口服葡萄糖耐量的影响
  • y小鼠空腹血糖和血胰岛素的影响'>4. BPI3006长期给药对KKAy小鼠空腹血糖和血胰岛素的影响
  • y小鼠食水及体重变化的影响'>5. BPI3006长期给药对KKAy小鼠食水及体重变化的影响
  • 实验小结
  • 第五节 BPI3006系列多肽体内活性比较
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 1. BPI3007对正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后血糖变化的影响
  • 2. BPI3008对正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷和进食后血糖变化的影响
  • 3. BPI3008B和BPI3011A对正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后血糖变化的影响
  • 实验小结
  • 全章讨论
  • 参考文献
  • 2HSA的抗糖尿病作用和作用机制研究'>第二章 长效GLP-1受体激动剂E2HSA的抗糖尿病作用和作用机制研究
  • 前言
  • 2HSA对正常ICR小鼠葡萄糖负荷后血糖变化以及体重和小肠蠕动等的影响'>第一节 E2HSA对正常ICR小鼠葡萄糖负荷后血糖变化以及体重和小肠蠕动等的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 2HSA单次给药对正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后血糖变化的影响'>1. E2HSA单次给药对正常ICR小鼠口服葡萄糖负荷后血糖变化的影响
  • 2HSA单次给药对正常ICR小鼠小肠蠕动的影响'>2. E2HSA单次给药对正常ICR小鼠小肠蠕动的影响
  • 2HSA单次给药对正常ICR小鼠体重和摄食量的影响'>3. E2HSA单次给药对正常ICR小鼠体重和摄食量的影响
  • 2HSA长期间隔给药对其抑制ICR小鼠口服葡萄糖负荷后血糖升高作用的影响'>4. E2HSA长期间隔给药对其抑制ICR小鼠口服葡萄糖负荷后血糖升高作用的影响
  • 2HSA长期间隔给药对正常ICR小鼠体重变化的影响'>5. E2HSA长期间隔给药对正常ICR小鼠体重变化的影响
  • 2HSA长期间隔给药诱导正常ICR小鼠产生抗体滴度的评价'>6. E2HSA长期间隔给药诱导正常ICR小鼠产生抗体滴度的评价
  • 2HSA长期间隔给药对正常ICR小鼠胰腺组织病理学变化的影响'>7. E2HSA长期间隔给药对正常ICR小鼠胰腺组织病理学变化的影响
  • 实验小结
  • 2HSA长期给药对四氧嘧啶小鼠血糖变化的影响'>第二节 E2HSA长期给药对四氧嘧啶小鼠血糖变化的影响
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 2HSA长期给药对四氧嘧啶小鼠非禁食和禁食血糖变化的影响'>1. E2HSA长期给药对四氧嘧啶小鼠非禁食和禁食血糖变化的影响
  • 2HSA长期给药对四氧嘧啶小鼠体重变化的影响'>2. E2HSA长期给药对四氧嘧啶小鼠体重变化的影响
  • 2HSA长期给药对四氧嘧啶小鼠摄食量和饮水量变化的影响'>3. E2HSA长期给药对四氧嘧啶小鼠摄食量和饮水量变化的影响
  • 2HSA对四氧嘧啶小鼠血清胰岛素和转氨酶水平的影响'>4. E2HSA对四氧嘧啶小鼠血清胰岛素和转氨酶水平的影响
  • 2HSA对四氧嘧啶小鼠血清SOD和MDA含量的影响'>5. E2HSA对四氧嘧啶小鼠血清SOD和MDA含量的影响
  • 2HSA对四氧嘧啶小鼠胰腺组织中SOD和MDA含量的影响'>6. E2HSA对四氧嘧啶小鼠胰腺组织中SOD和MDA含量的影响
  • 2HSA对四氧嘧啶小鼠肝脏组织中SOD、MDA和糖原含量的影响'>7. E2HSA对四氧嘧啶小鼠肝脏组织中SOD、MDA和糖原含量的影响
  • 2HSA长期给药诱导四氧嘧啶小鼠产生抗体滴度的评价'>8. E2HSA长期给药诱导四氧嘧啶小鼠产生抗体滴度的评价
  • 2HSA对四氧嘧啶小鼠胰腺组织病理学变化的影响'>9. E2HSA对四氧嘧啶小鼠胰腺组织病理学变化的影响
  • 2HSA对四氧嘧啶小鼠胰岛内胰岛素含量的影响'>10. E2HSA对四氧嘧啶小鼠胰岛内胰岛素含量的影响
  • 实验小结
  • 2HSA对瞬时转染NIT-1细胞的小鼠胰岛素基因表达的影响和相关机制'>第三节 E2HSA对瞬时转染NIT-1细胞的小鼠胰岛素基因表达的影响和相关机制
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 1. Peak 12 Ins 1-Luciferase报告质粒的制备
  • 2HSA对NIT-1细胞内瞬时转染RIP1-6xCRE报告基因表达的影响'>2. E2HSA对NIT-1细胞内瞬时转染RIP1-6xCRE报告基因表达的影响
  • 2HSA促进RIP1-6xCRE报告基因表达的影响'>3. GLP-1受体阻断剂Exendin-4（9-39）对E2HSA促进RIP1-6xCRE报告基因表达的影响
  • 2HSA对NIT-1细胞内瞬时转染胰岛素报告基因表达的影响'>4. E2HSA对NIT-1细胞内瞬时转染胰岛素报告基因表达的影响
  • 2HSA促进胰岛素基因表达的影响'>5. GLP-1受体阻断剂Exendin-4（9-39）对E2HSA促进胰岛素基因表达的影响
  • 2HSA促进胰岛素基因表达的影响'>6. PKA抑制剂H-89对E2HSA促进胰岛素基因表达的影响
  • 2HSA促进胰岛素基因表达的影响'>7. cAMP生成抑制剂MDL12330A对E2HSA促进胰岛素基因表达的影响
  • 2HSA促进胰岛素基因表达的影响'>8. PI3K抑制剂LY294002对E2HSA促进胰岛素基因表达的影响
  • 2HSA促进胰岛素基因表达的影响'>9. ERK1/2抑制剂U0126对E2HSA促进胰岛素基因表达的影响
  • 实验小结
  • 2HSA对NIT-1细胞增殖的影响和相关机制'>第四节 E2HSA对NIT-1细胞增殖的影响和相关机制
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 2HSA对NIT-1细胞活力的影响'>1. E2HSA对NIT-1细胞活力的影响
  • 2HSA对NIT-1细胞增殖的作用'>2. BrdU嵌入法考察E2HSA对NIT-1细胞增殖的作用
  • 3. 引物特异性鉴定
  • 2HSA对NIT-1细胞增殖相关基因表达的作用'>4. E2HSA对NIT-1细胞增殖相关基因表达的作用
  • 实验小结
  • 2HSA对NIT-1细胞损伤的保护作用和作用机制'>第五节 E2HSA对NIT-1细胞损伤的保护作用和作用机制
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 2HSA对Act D诱导NIT-1细胞损伤后细胞活力的影响'>1. E2HSA对Act D诱导NIT-1细胞损伤后细胞活力的影响
  • 2HSA对水溶性胆固醇诱导NIT-1细胞损伤后细胞活力的影响'>2. E2HSA对水溶性胆固醇诱导NIT-1细胞损伤后细胞活力的影响
  • 2HSA对佛波酯诱导NIT-1细胞损伤后细胞活力的影响'>3. E2HSA对佛波酯诱导NIT-1细胞损伤后细胞活力的影响
  • 2HSA对高糖高脂诱导NIT-1细胞损伤后细胞活力的影响'>4. E2HSA对高糖高脂诱导NIT-1细胞损伤后细胞活力的影响
  • 2HSA对Act D诱导NIT-1细胞损伤后细胞形态的影响'>5. E2HSA对Act D诱导NIT-1细胞损伤后细胞形态的影响
  • 2HSA对Act D诱导NIT-1细胞凋亡的影响'>6. E2HSA对Act D诱导NIT-1细胞凋亡的影响
  • 2HSA对Act D诱导NIT-1细胞损伤后细胞周期变化的影响'>7. E2HSA对Act D诱导NIT-1细胞损伤后细胞周期变化的影响
  • 2HSA对水溶性胆固醇诱导NIT-1细胞凋亡的影响'>8. E2HSA对水溶性胆固醇诱导NIT-1细胞凋亡的影响
  • 2HSA对Act D诱导NIT-1细胞凋亡后胞内AKT和PDX-1蛋白表达的影响'>9. E2HSA对Act D诱导NIT-1细胞凋亡后胞内AKT和PDX-1蛋白表达的影响
  • 2HSA对水溶性胆固醇诱导NIT-1细胞凋亡后胞内AKT和PDX-1 #1蛋白表达的影响'>10. E2HSA对水溶性胆固醇诱导NIT-1细胞凋亡后胞内AKT和PDX-1 #1蛋白表达的影响
  • 实验小结
  • 全章讨论
  • 参考文献
  • 第三章 肥胖性MSG小鼠特征及其发生高血糖的机制研究
  • 前言
  • 第一节 肥胖性MSG小鼠的特征和高血糖MSG小鼠的发现
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 1. MSG小鼠的肥胖特征
  • 2. MSG小鼠对胰岛素作用的敏感性
  • 3. MSG小鼠高血糖的发生及其血胰岛素水平的比较
  • 4. IR-MSG和HG-MSG小鼠的体重、各组织重量和脏器指数
  • 实验小结
  • 第二节 IR-MSG和HG-MSG小鼠胰腺组织变化
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 1. MSG小鼠胰腺组织生化指标
  • 2. MSG小鼠胰腺组织病理学特征
  • 3. MSG小鼠胰岛α细胞和β细胞之间相对平衡的变化
  • 4. Real-time PCR所用引物的特异性考察
  • 5. MSG小鼠胰腺损伤和生存相关基因表达的变化
  • 6. MSG小鼠胰腺组织蛋白双向电泳图谱
  • 实验小结
  • 第三节 IR-MSG和HG-MSG小鼠肝脏组织变化
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 1. MSG小鼠肝脏组织中甘油三酯和胆固醇水平
  • 2. MSG小鼠肝脏组织中SOD,MDA和糖原含量
  • 3. MSG小鼠肝脏组织中炎症相关因子和GK基因表达的变化
  • 4. MSG小鼠肝脏组织中IRS-2、PCNA和GYS基因表达的变化
  • 5. MSG小鼠肝脏组织中PPAR α和PPAR γ基因表达的变化
  • 6. MSG小鼠肝脏组织中NF-κB和JNK基因表达的变化
  • 7. MSG小鼠肝脏组织蛋白双向电泳图谱
  • 实验小结
  • 第四节 IR-MSG和HG-MSG小鼠脂肪组织变化
  • 材料与方法
  • 实验结果
  • 1. MSG小鼠脂肪组织中脂肪因子基因表达的变化
  • 2. MSG小鼠脂肪组织中炎症因子和免疫调节因子基因表达的变化
  • 3. MSG小鼠脂肪组织中Glut 4、IR和IRS-1基因表达的变化
  • 4. MSG小鼠脂肪组织中PPARα和PPARγ基因表达的变化
  • 实验小结
  • 全章讨论
  • 参考文献
  • 全文总结及创新点
  • 综述
  • 参考文献
  • 个人简历
  • 致谢

    • 相关论文文献

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