我国南海相似蜂海绵相关微生物多样性及活性产物研究

论文摘要

海绵是最原始的低等多细胞动物,主要分布于海洋环境,其特殊的滤食和生存方式使之成为大量微生物聚集的场所,还从海绵中发现了大量的生物活性物质。海绵相关微生物尤其是微生物新种也被陆续发现,并分离到许多具有药理活性的微生物代谢产物。本课题致力于将分离培养技术与分子生物学手段（RFLP和核糖体rRNA序列分析）相结合,研究我国南海相似蜂海绵相关微生物多样性,同时从可培养的微生物中筛选可应用于创新药物研究的活性产物,已取得如下进展：1.调查了相似蜂海绵相关可培养真菌多样性利用三种不同培养基：海水YPD、海水PDA和Marine Agar从海绵内部组织匀浆中分离培养得到45株真菌,经过rDNA-ITS序列测定、BLAST比对和分子系统学分析,最终将它们归属于2门（子囊菌门和担子菌门）、8目、12属和16种,其中6株有可能为首次发现的新种。上述菌株有待于进一步的分类鉴定。2.调查了相似蜂海绵相关可培养细菌和未培养细菌的多样性采用四种不同的培养基：Marine Agar、海水LB、海水高氏1号和高氏1号固体培养基,分离培养得到350株细菌,经RFLP分析,得到89个RFLP型,再通过16SrDNA序列测定、BLAST比对和分子系统学分析,最终将这些细菌归类为38种。另外,通过构建16S rRNA基因（rDNA）文库、RFLP分析、DNA测序等方法分析了海绵相关未培养细菌的种群,共得到32个互不相同的序列,分别表征不同细菌菌株。3.对可培养微生物进行了药理活性筛选,得到多株能产生药理活性物质的菌株将分离得到的真菌和细菌,分别采用GC和TSB培养基25℃发酵培养7天。真菌发酵物用乙酸乙酯提取和浓缩得浸膏,用三种肿瘤细胞株人肠癌HCT-8细胞,人肝癌Bel-7402细胞和人肺癌A549细胞进行体外抗肿瘤活性筛选；用枯草芽孢杆菌63501进行抗菌活性筛选；用BACE进行抗衰老活性筛选；用α-葡萄糖苷酶抑制模型和脂肪酶抑制模型等体外模型进行抗糖尿病活性筛选。初筛得到如下结果：1株具有体外抗肿瘤活性、7株具有抗菌活性、4株具有一定抗衰老活性和1株具有一定抗糖尿病活性。细菌发酵液取上清直接进行抗菌活性筛选,初筛获得2株有抗菌活性的细菌菌株。对真菌菌株F62的发酵物进行了分离纯化研究,通过柱层析和高效液相色谱层析等方法,获得1种具有抗菌活性的化合物,其结构有待于进一步鉴定。

论文目录

• 目录
• 缩略词表
• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 参考文献
• 第二章 实验材料及方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 工具酶类
• 2.1.2 试剂盒
• 2.1.3 Marker
• 2.1.4 培养基成分
• 2.1.5 PCR引物
• 2.1.6 抗生素
• 2.1.7 其它试剂
• 2.1.8 实验仪器
• 2.1.9 培养基
• 2.1.10 试剂和溶液配制
• 2.1.11 抗生素的配制
• 2.1.12 生物信息学软件
• 2.1.13 菌株和质粒载体
• 2.2 方法
• 2.2.1 真菌基因组提取
• 2.2.2 细菌菌落PCR
• 2.2.3 海绵总基因组提取
• 2.2.4 DNA片段纯化回收
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.6 TA克隆
• 2.2.7 16S rRNA基因的限制性酶切片段多态性分析（RFLP）
• 2.2.8 使用软件构建系统发育树
• 2.2.9 硅胶柱层析
• 2.2.10 HPLC分析和制备
• 2.2.11 枯草芽孢杆菌63501孢子悬液制备
• 2.2.12 钢圈法抗菌活性筛选实验
• 2.2.13 纸片法抗菌活性筛选实验
• 第三章 相似蜂海绵（Haliclona simulans）相关真菌多样性研究
• 3.1 实验方法
• 3.1.1 海绵样品采集和处理
• 3.1.2 真菌分离
• 3.1.3 菌种保藏
• 3.1.4 真菌分子系统学分析
• 3.2 实验结果
• 3.2.1 分离得到真菌菌株菌落形态
• 3.2.2 基因组提取的结果
• 3.2.3 ITS序列扩增的结果
• 3.2.4 BLAST比对结果
• 3.2.5 分子系统学分析结果
• 3.2.6 GenBank注册号
• 第四章 相似蜂海绵（Haliclona simulans）相关细菌多样性研究
• 4.1 可培养细菌多样性研究
• 4.1.1 实验方法
• 4.1.2 菌种保藏
• 4.1.3 菌落PCR获得各菌株16S rRNA序列
• 4.1.4 限制性酶切片段长度多态性分析（RFLP）
• 4.1.5 测序
• 4.1.6 序列编辑和比对
• 4.1.7 BLAST
• 4.1.8 系统树构建
• 4.1.9 GenBank注册
• 4.2 实验结果
• 4.2.1 分离结果
• 4.2.2 16 SrRNA基因序列扩增结果
• 4.2.3 RFLP分析结果
• 4.2.4 BLAST比对结果
• 4.2.5 分子系统学分析结果
• 4.2.6 GenBank注册号
• 4.3 相似蜂海绵相关未培养细菌多样性分析
• 4.3.1 海绵组织总基因组DNA的提取
• 4.3.2 构建16S rRNA基因序列文库
• 4.3.3 RFLP分析16S rRNA基因文库
• 4.3.4 测序
• 4.3.5 序列编辑和比对
• 4.3.6 构建系统树
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 总基因组提取结果
• 4.4.2 16S rRNA基因文库构建的结果
• 4.4.3 RFLP分析结果
• 4.4.4 BLAST比对结果
• 4.4.5 分子系统学分析
• 4.4.6 GenBank注册号
• 4.5 讨论
• 第五章 相似蜂海绵相关微生物代谢产物研究
• 5.1 实验方法
• 5.1.1 真菌的发酵
• 5.1.2 细菌的发酵
• 5.1.3 发酵产物提取
• 5.1.4 活性筛选
• 5.1.5 活性物质分离
• 5.2 实验结果
• 5.2.1 抗肿瘤筛选结果
• 5.2.2 抗衰老筛选结果
• 5.2.3 抗菌活性筛选结果
• 5.2.4 抗糖尿病筛选结果
• 5.2.5 F62分离结果
• 5.3 小结
• 第五章 全文总结
• 第六章 中国海绵生理活性物质研究新进展（综述）
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 附图