论文摘要
目的:（1）观察褪黑素（MEL）对体外培养的人肺癌细胞（A549）、胰腺癌细胞（PANC-1）以及宫颈癌细胞（HeLa）的影响。（2）观察氯化钴（CoCl2）对A549、PANC-1以及HeLa细胞存活状况的影响。（3）研究MEL在常氧状态下对A549、PANC-1以及HeLa细胞中VEGF表达的影响。（4）研究MEL在CoCl2模拟的低氧状态下对A549、PANC-1以及HeLa细胞中VEGF表达的影响。（5）进一步研究MEL对三种肿瘤细胞中VEGF表达的调控机制以及信号传导途径。方法:（1）体外培养A549、PANC-1以及HeLa细胞。应用MTT法检测MEL对肿瘤细胞存活、增殖及凋亡的影响。（2）应用MTT法检测CoCl2对体外培养的肿瘤细胞存活、增殖及凋亡的影响。（3）RT-PCR检测在常氧和CoCl2模拟的低氧状态下,MEL与肿瘤细胞共培养以后,肿瘤细胞中VEGF mRNA的表达水平。（4）WesternBlot检测常氧和CoCl2模拟的低氧状态下,MEL与肿瘤细胞共培养后,肿瘤细胞中VEGF和HIF-1α蛋白的表达。（5）ELISA检测MEL作用以及MEL与CoCl2共同作用24h后,肿瘤细胞培养液中VEGF的含量。结果:（1）0～150μmol/L CoCl2不影响肿瘤细胞的增殖活性,加大浓度后会明显减少活细胞数量;250～500μmol/L的CoCl2可以引起肿瘤细胞的少量凋亡。（2）在3种肿瘤细胞中,CoCl2都可以模拟低氧状态,抑制HIF-1α降解,诱导VEGF表达升高。（3）生理浓度MEL（1nmol/L）对肿瘤细胞增殖无明显影响,但药理浓度MEL（1mmol/L）明显抑制3种肿瘤细胞增殖,并具有浓度依赖倾向。（4）生理浓度MEL（1nmol/L）对肿瘤细胞VEGF基础表达水平以及CoCl2诱导的HIF-1α以及VEGF表达水平无明显影响。（5）药理浓度MEL（1mmol/L）明显抑制CoCl2诱导的HIF-1α以及VEGF的表达。结论:（1）100μmol/L CoCl2对肿瘤细胞的增殖几乎没有影响。（2）生理浓度（1nmol/L）的MEL抑制肿瘤细胞增殖的效果不明显,药理浓度（1mmol/L）的MEL能明显抑制肿瘤细胞增殖。（3）而生理浓度（1nmol/L）的MEL在我们研究的时间范围内没有调控HIF-1α以及VEGF的表达的效果,药理浓度（1mmol/L）的MEL能明显抑制CoCl2诱导的HIF-1α以及VEGF表达。（4）药理浓度的MEL可能具有抗肿瘤血管新生的作用,起到化疗增敏的作用。目的:（1）观察和评价肿瘤组织微环境中氧含量的改变以及微血管形态、数量的改变。（2）研究新型血红蛋白类氧载体（PEG-Hb）能否改善肿瘤低氧微环境以及其对肿瘤血管新生的影响。（3）研究PEG-Hb联合化疗对肿瘤生长的影响,能否作为肿瘤化疗增敏剂用于肿瘤治疗。（4）研究PEG-Hb对肿瘤低氧微环境以及微循环功能影响的分子机制。方法:（1）将体外培养的HeLa细胞接种于3～4周雌性BALB/c裸鼠腋下（2×106细胞/只）,构建肿瘤模型。（2）肿瘤细胞接种2周后,选取肿瘤大小在60～80mm3的裸鼠,随机分为5组（n=10）,分别给与以下处理:第一组:对照组,尾静脉注射生理盐水,每周两次;第二组:单纯化疗组,尾静脉注射顺铂注射液（5mg/kg体重）,每周两次;第三组:低剂量PEG-Hb组,尾静脉注射顺铂注射液（5mg/kg体重）+PEG-Hb溶液（0.3g/kg体重）,每周两次;第四组:高剂量PEG-Hb组,尾静脉注射顺铂注射液（5mg/kg体重）+PEG-Hb溶液（0.6g/kg体重）,每周两次。第五组:单纯PEG-Hb组,尾静脉注射PEG-Hb（0.45g/kg体重）,每周两次。（3）游标卡尺测量肿瘤大小,每周两次,并绘制肿瘤生长曲线。（4）药物处理一月后处死动物。处死前大约1h腹腔注射Hypoxyprobe 1（哌莫硝唑）（60mg/kg体重）,动物处死后利用HypoxyprobeTM-1试剂盒进行免疫组化,检测肿瘤组织低氧状态。（5）利用免疫组化法检测肿瘤组织中,HIF,VEGF以及CD31表达水平。（6）处死动物时,腹主动脉取血。利用ELISA试剂盒检测动物血清VEGF表达水平。（7）提取肿瘤组织总蛋白,利用Western Blot方法检测HIF,VEGF蛋白表达水平的变化。（8）提取肿瘤组织总RNA,利用RT-PCR方法检测VEGF mRNA表达水平的变化。（9）将2×106个HeLa细胞接种于3～4周雌性金黄地鼠颊囊上,构建肿瘤血管新生模型。将金黄地鼠随机分为4组（n=10）,第一组:对照组,颈静脉插管,注射生理盐水,每周两次;第二组:单纯化疗组,腹腔注射顺铂注射液（5mg/kg体重）,每周两次;第三组:低剂量PEG-Hb组,腹腔注射顺铂注射液（5mg/kg体重）+颈静脉插管注射PEG-Hb溶液（0.3g/kg体重）,每周两次;第四组:高剂量PEG-Hb组,腹腔注射顺铂注射液（5mg/kg体重）+颈静脉插管注射PEG-Hb溶液（0.6g/kg体重）,每周两次。接种肿瘤细胞的第0、3、5和7天利用计算机辅助的活体显微镜观察、录制颊囊血管以及血流情况。并通过图像分析软件计算血管迂曲度和血管密度的变化。结果:（1）PEG-Hb溶液可以增强顺铂的抑瘤效应,抑制肿瘤生长。高浓度组效果强于低浓度组,单纯PEG-Hb组与对照组相比较没有明显差异。与此同时,PEG-Hb组动物体重下降明显大于对照组。（2）PEG-Hb组HypoxyprobeTM-1免疫组化染色阳性程度明显低于其他组,高浓度PEG-Hb组低于低浓度PEG-Hb组。（3）免疫组化染色结果显示PEG-Hb组HIF,VEGF和CD31表达水平明显低于对照组。（4）Western Blot结果显示PEG-Hb组HIF和VEGF蛋白表达水平低于其他组。（5）RT-PCR结果显示PEG-Hb组VEGF mRNA水平低于其他组。（6）金黄地鼠肿瘤血管图像分析表明PEG-Hb组肿瘤微血管密度和血管迂曲度低于对照组。结论:（1）肿瘤组织存在低氧微环境,微血管迂曲度增加,微血管密度增加。（2）PEG-Hb联合顺铂治疗可以增强顺铂的抑瘤效应,具有化疗增敏作用。（3）PEG-Hb可以增加肿瘤组织氧含量,改善肿瘤组织低氧微环境。（4）PEG-Hb可以降低肿瘤组织中血管新生相关因子VEGF的表达水平,减轻肿瘤血管新生。（5）PEG-Hb可以降低新生血管密度以及迂曲度,使肿瘤新生血管正常化。（6）PEG-Hb抑制肿瘤肿瘤血管新生效应是由于其增加组织氧合水平,通过HIF信号传导途径。
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