论文摘要
严重烧伤早期发生的“休克心”,是诱发或加重烧伤休克,导致其他组织器官缺血缺氧损害和功能障碍的重要原因之一,因此在烧伤早期实施有效的心肌保护措施对纠正休克、防治组织器官缺血缺氧损害具有重要意义。近年来的研究提出,游离的甘氨酸具有显著的细胞保护作用。甘氨酸可明显减轻缺血、再灌注所致的骨骼肌损伤;减轻细胞因子的释放及钙超载和氧自由基的产生;还能减轻内毒素血症,降低内毒素血症大鼠的死亡率。但甘氨酸是否对烧伤后心肌组织具有保护作用及其作用机制尚未见报道。本研究通过建立体外培养的乳鼠心肌细胞缺血缺氧模型和大鼠30%烧伤模型,从心肌的能量、酶学及受体的证实等一系列指标,以明确甘氨酸对烧伤早期大鼠心肌损害的保护作用及心肌组织存在甘氨酸受体α1亚基。然后通过观察体外培养的心肌细胞,明确甘氨酸的最佳作用浓度,检测心肌细胞膜甘氨酸受体、钙离子、细胞膜电位、线粒体膜电位、mPTP开放、capase-3及其凋亡的变化,探讨甘氨酸保护作用机理。材料与方法:一、体外实验1.模型与分组:离体培养的SD乳鼠心肌细胞,分为常氧组（N）、常氧加甘氨酸组（NG）、缺血缺氧组（1%氧浓度）（H）、甘氨酸处理加缺血缺氧组（GH组）、甘氨酸加甘氨酸受体激动剂Taurine加缺血缺氧组（GTH）、甘氨酸加anti-GlyRα1多克隆抗体加缺血缺氧组（iGH）。2.观测指标和方法（1）缺血缺氧1、3、6、12、24h后,刮取细胞用高效液相色谱检测ATP、ADP、AMP含量、EC及ATP/AMP比值。缺血缺氧1、3、6、12、24h后,刮取细胞,提取总RNA,采用RT-PCR方法检测TNF-αmRNA的表达;缺血缺氧6h后,取细胞培养上清液,紫外分光光度计测LDH含量,缺氧6h后心肌细胞存活率采用CCK-8检测及PI染色。（2）离体培养的大鼠心肌细胞,采用特异荧光探针,在激光共聚焦下检测缺氧6h后心肌细胞游离钙、细胞膜电位、线粒体膜电位、mPTP开放及心肌细胞凋亡（Annex-V）的变化,生化方法检测capase-3的激活。（3）心肌细胞甘氨酸受体各亚基检测,采用神经细胞做阳性对照,免疫组织化学荧光染色、RT-PCR及Western-Blot检测。二、动物实验1.模型与分组:采用SD大鼠致成30%TBSAⅢ°烫伤模型,试验分为正常组（N）、烧伤组（B）和甘氨酸处理组（G）。2.观测指标和方法（1）烧伤后1、3、6、12、24h后,心肌组织甘氨酸受体α1亚基表达变化规律,采用Western-Blot检测。（2）烧伤后1、3、6、12、24h后,取心肌组织用高效液相色谱检测ATP、ADP、AMP、EC含量,常规方法检测血清中LDH含量。（3） ELISA检测血清中TnI含量。主要结果:一、体外实验1.缺血缺氧导致培养心肌细胞能量储备降低,包括减少ATP及EC含量,ATP/ADP比值减少,ADP、AMP含量增加,随缺氧时间的延长,心肌细胞能量储备损失逐渐加重,而加入甘氨酸可以明显改善缺血缺氧心肌细胞能量储备。2.缺血缺氧使心肌细胞损伤明显,表现为LDH释放增加,PI染色阳性细胞明显增加,TNF-αmRNA表达明显增高,而加入甘氨酸可明显降低细胞培养液中LDH含量,PI染色阳性细胞明显减少,TNF-αmRNA表达较单纯缺血缺氧组显著减少。同时证实甘氨酸在5mmol/L时保护作用最大。3. Annexin V检测心肌细胞早期凋亡,应用5mmol/L甘氨酸可以明显减轻心肌细胞的凋亡。4.本实验首次证实在心肌细胞存在甘氨酸受体。以神经元细胞为阳性对照,RT-PCR检测心肌细胞表达GlyRα1、2及β亚基mRNA;Western-blot检测结果也证实在心肌细胞存在GlyRα1及β亚基;免疫组化证实在心肌细胞存在GlyR的α1亚基;缺血缺氧1、3、6、12、24h检测心肌细胞功能性亚基GlyRα1表达变化,可见在缺血缺氧6h后甘氨酸受体表达较正常组明显增强。表明在心肌细胞均存在甘氨酸受体。5.心肌细胞缺血缺氧6h后,细胞膜电位荧光强度明显降低;钙离子荧光强度明显增强,线粒体膜电位荧光强度显著降低,mPTP开放增加,capase-3释放明显增加,而加入甘氨酸后,细胞膜电位荧光强度明显升高;钙离子荧光强度明显降低,线粒体膜电位荧光强度显著增强,mPTP开放减少,capase-3释放明显减少;加入甘氨酸受体激动剂Taurine后,各项指标变化与加入甘氨酸组变化一致;而加入anti-GlyRα1阻断甘氨酸受体α1亚基后,各项指标变化与加入甘氨酸组的结果相反。二、动物实验1.心肌组织有甘氨酸受体α1亚基蛋白表达,烧伤后1h开始其表达明显增强,烧伤后6h达高峰,12、24h逐渐降低。表明组织存在甘氨酸受体α1亚基。2.烫伤后3h开始大鼠血清中LDH明显升高,伤后6h达高峰,后逐渐回落。而甘氨酸处理组与烧伤组比较,血清中LDH含量明显降低（P<0.01）3.烧伤3h开始,烧伤后心肌组织ATP、EC明显降低,ADP、AMP含量明显升高,而甘氨酸干预后从伤后3h开始ATP、EC含量显著升高,ADP、AMP含量明显相应降低。4.烫伤后1h,TnI即明显升高,伤后6h达高峰,后渐回落。而甘氨酸处理组血清TnI与烧伤组相比明显降低。讨论与结论:1.本研究证明,甘氨酸对体外培养的缺血缺氧心肌细胞具有显著的保护作用,表现为缺血缺氧心肌细胞ATP和EC含量、ATP/ADP比值均增加、ADP和AMP含量均减少,细胞培养上清液中LDH释放减少,细胞活力明显改善,PI染色阳性细胞明显减少,心肌细胞凋亡减少,TNF-αmRNA表达降低。甘氨酸在5mmol/L时,对缺血缺氧心肌细胞的保护作用最大。2.证实了在心肌细胞存在甘氨酸受体。以神经元细胞为阳性对照,RT-PCR检测心肌细胞表达GlyRα1、2及β亚基mRNA;Western-blot检测结果也证实在心肌细胞存在GlyRα1及β亚基;免疫组化证实在心肌细胞存在GlyR的α1亚基;缺血缺氧1、3、6、12、24h检测心肌细胞功能性亚基GlyRα1表达变化,可见缺血缺氧6h后甘氨酸受体表达较正常组明显增强。3.缺血缺氧后,心肌细胞膜发生去极化,细胞膜电压依赖性钙通道开放增加,钙离子内流增多,使线粒体膜电位降低及mPTP开放,激活凋亡激酶导致细胞凋亡。4.证明了甘氨酸抑制缺血缺氧心肌细胞凋亡的作用机制为:心肌细胞与组织存在甘氨酸受体,甘氨酸与其受体结合后,导致心肌细胞膜去极化明显减轻,从而使细胞膜电压依赖性钙通道开放减少,钙离子内流明显减少,升高缺血缺氧心肌细胞线粒体膜电位,减轻mPTP孔的开放,使Caspase-3活化减少,从而发挥抗凋亡作用。5.证实在心肌组织存在甘氨酸受体α1亚基,大鼠烧伤30%TBSAⅢ°烫伤后,心肌组织甘氨酸受体α1亚基于烧伤后1h表达明显增强,烧伤后6h达高峰;甘氨酸对烧伤心肌组织具有保护作用,可使烧伤后3h开始ATP含量及EC明显升高,ADP和AMP含量显著降低;大鼠血清中LDH、TnI较烧伤组均明显下降。这些结果为烧伤早期“休克心”的防治,特别是烧伤后心肌的外源性保护提供了新的思路和方法。