TSA在脑缺血再灌注损伤中的脑保护机制 ——CXCL12-CXCR4信号通路的作用

论文摘要

目的：采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑素A （trichostatin-A,TSA）对大鼠短暂性大脑中动脉缺血再灌注损伤（Transient Middle cerebral artery occlusion, tMCAO）模型进行缺血后静脉注射,观察化学趋化因子CXCL12/CXCR4、组蛋白H3和组蛋白H4的乙酰化水平的时空变化规律,探索TSA对tMCAO大鼠的脑保护作用机制,验证TSA在脑缺血再灌注损伤中可以通过对CXCL12/CXCR4信号通路的调控产生脑保护作用。方法：1.健康雄性SD大鼠随机分为4组：I/R组、TSA组、溶剂对照组（DMSO）和假手术组（Sham）。I/R组按照Zea-Longa线栓法的方法建立大鼠左侧大脑中动脉缺血90分钟后再灌注的损伤模型。Sham组的手术操作步骤同I/R组,但是不进行大脑中动脉栓塞。TSA组分为三个亚组,分别在大脑中动脉栓塞成功后立即尾静脉注射不同剂量的TSA:TSA1组--注射TSA0.03Mg/kg; TSA2组--注射TSA0.1Mg/kg;TSA3组--注射TSA0.3Mg/kg。DMSO组：大脑中动脉栓塞成功后立即尾静脉注射1%DMSOlml。分别于再灌注后6h和24h进行神经功能缺陷评分,之后处死取材,行TTC染色测量脑梗死容积。2.健康雄性SD大鼠随机分为I/R组和Sham组,造模方法同1。分别于再灌注后6h、24h、72h和7天各时点行大鼠神经功能缺陷评分,之后处死取材,一部分实验动物取新鲜大脑缺血侧皮质深低温冻存后进行Weston-Blot检测CXCL12、CXCR4、Ac-H3和Ac-H4的蛋白表达变化,另一部分实验动物以4%多聚甲醛灌注后用于免疫组织化学法检测CXCL12、CXCR4在脑组织及细胞的免疫阳性分布。3.健康雄性SD大鼠随机分为4组：I/R组、TSA组、溶剂对照组（DMSO）和Sham组。造模方法同1,TSA组在栓塞成功后立即静脉注射TSA0.1 Mg/kg。分别于再灌注后6h、24h、72h和7天各时点行大鼠神经功能缺陷评分,之后处死取材,一部分实验动物以4%多聚甲醛灌注后用于免疫组织化学法检测CXCL12、CXCR4在脑组织及细胞的免疫阳性分布。另一部分实验动物取新鲜大脑皮质深低温冻存后进行Western-Blot检测CXCL12、CXCR4、Ac-H3和Ac-H4的蛋白表达变化,Real-time PCR法检测CXCL12和CXCR4的mRNA表达变化。结果：1.神经功能缺陷评分和脑梗死容积：与sham组相比较,TSA组和I/R组均出现程度不同的神经生物学缺陷,神经功能缺陷评分在2～5分之间,sham组无神经功能缺陷。与tMCAO组相比较,TSA0.3mg/kg组无明显改善大鼠的神经功能缺损评分,与I/R组无显著差异。虽然脑梗死容积有所减少,但差异无统计学意义。TSA0.03mg/kg和0.1mg/kg组均可以降低神经功能缺陷评分,显著减少脑梗死容积,TSA0.03mg/kg和0.1mg/kg组较I/R组分别减少脑梗死容积43.5%和42.8%。TSA0.03mg/kg组和0.1mg/kg组比较无显著性差异。2.CXCL12、CXCR4的免疫组织化学检测。与sham组相比较,tMCAO大鼠缺血侧大脑皮质CXCL12免疫阳性细胞数下降,CXCR4免疫阳性细胞达无显著改变。与I/R组相比较,TSA组CXCL12和CXCR4的免疫阳性细胞显著升高。CXCL12、CXCR4和GFAP、NeuN的荧光双标结果显示,CXCL12、CXCR4的免疫阳性表达和NeuN的免疫阳性表达高度匹配,和GFAP无明显匹配,但是和GFAP的免疫阳性表达区域存在一致性。3.tMCAO大鼠缺血侧大脑皮质CXCL12、CXCR4、Ac-H3和Ac-H4的蛋白和mRNA的表达变化。与sham组相比较,I/R组的CXCL12、Ac-H3和Ac-H4的蛋白和（?）mRNA表达水平显著下降,直持续至再灌注后7天,但是tMCAO组CXCR4的蛋白和mRNA的表达水平无显著变化。TSA组在术后前24小时可升高CXCL12的蛋白和mRNA表达水平,72h后与sham组无显著差异。TSA组CXCR4的蛋白和mRNA表达水平较sham组显著升高,持续至再灌注后7天。TSA组Ac-H3的蛋白表达水平较sham组降低,但是较I/R组显著升高。TSA组Ac-H4的蛋白表达水平和sham组无显著差异。结论：1.对tMCAO大鼠缺血后单次静脉注射0.03mg/kg和0.1mg/kg的去乙酰化酶抑制剂TSA可以减少脑梗死容积,改善神经生物学功能。而注射0.3mg/kg的TSA却无明显的脑保护作用。2. tMCAO大鼠缺血再灌注损伤后组蛋白H3、H4的乙酰化水平下降,伴随CXCL12表达的下降,TSA可以显著减弱CXCL12、Ac-H3和Ac-H4的下降幅度,并且显著提高CXCR4的表达水平。提示去乙酰化酶抑制剂TSA可以通过调控CXCL12、CXCR4信号通路对脑缺血损伤起到脑保护作用。3.神经元细胞内可以同时表达CXCL12及其受体CXCR4,提示CXCL12-CXCR4的反应是在神经细胞内以自分泌的方式完成的。本模型中星型胶质细胞自身并未表达CXCL12和CXCR4。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词简表
• 前言
• 第一章 对tMCAO大鼠缺血后静脉注射不同剂量TSA的脑保护作用
• 1.1 实验动物与材料
• 1.2 实验方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 第二章 脑缺血再灌注损伤后Ac-H3、Ac-H4、CXCL12及CXCR4的时空表达
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 第三章 CXCL12-CXCR4信号通路介导TSA缺血后处理的脑保护效应
• 3.1 实验动物与材料
• 3.2 实验方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 全文结论
• 参考文献
• 综述:组蛋白去乙酰化酶抑制剂在神经系统疾病中的研究进展
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间主要研究成果