镰孢霉CPCC480097来源的纤溶酶的研究

论文摘要

鉴于心脑血管疾病对人类生命和健康的严重威胁,溶栓药物的研制一直是新药研发的重要领域。本文以一株产生具有较强纤溶活性物质的植物内生真菌CPCC 480097为对象,进行了研究,内容包括:首先,通过菌种纯化、复壮获得了活性稳定的菌株CPCC 480097。该菌经形态学观察和18S rDNA、ITS序列的分析比对,鉴定为镰孢霉属（Fusarium sp.）。其产生的纤溶酶,命名为HCCB00699S1。对CPCC 480097产纤溶酶的发酵条件进行了优化。采用优化后的发酵条件,发酵液的活性是初始发酵水平的2倍。考察了粗酶在不同温度、酸碱度、盐溶液等条件下的稳定性。结果表明,粗酶具有较好的热稳定性和pH稳定性,一些因素包括NaCl溶液、（NH4）2SO4溶液以及少次反复冻融对酶的稳定性影响都不大,而有机溶剂丙酮和乙醇易使酶失活。通过离心、硫酸铵分级沉淀、微滤、超滤、Mono-Q离子交换层析、Superder 75凝胶过滤等过程,对该纤溶酶进行了分离纯化。从1升发酵液中纯化出1.8mg电泳纯的HCCB00699S1,其总回收率为6.8%。对HCCB00699S1的基本参数进行了测定:其比活为76,111.1U/mg,相对分子质量约28kDa,为单链蛋白,等电点8.1。测定得到其N末端15个氨基酸序列为QASSGTPATIRVLVV。经与已报道的纤溶酶N端氨基酸序列比较无同源性,说明HCCB00699S1可能为一种新的纤溶酶。对HCCB00699S1的酶学性质进行了初步考察。测得其最适反应pH为8.5,最适反应温度为45℃,在pH 6～9之间和4℃～37℃内表现出较好的稳定性,但更适宜干燥低温保存。蛋白酶抑制剂对酶活性影响试验显示该酶为丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 绪论
• 1.绪论
• 1.1.血栓形成机理
• 1.2.抗血栓机理
• 1.2.1.抗凝系统
• 1.2.2.溶栓系统
• 1.3.溶栓药物的研究进展
• 1.4.纤溶酶的来源及微生物产纤溶酶的研发状况
• 1.4.1.纤溶酶的来源
• 1.4.2.微生物产纤溶酶的研发现状
• 1.5.植物内生菌的研究概况
• 1.5.1.植物内生菌的定义
• 1.5.2.植物内生真菌的多样性
• 1.5.3.植物内生真菌产生的活性代谢产物研究进展
• 1.6.立题依据
• 第二章 植物内生真菌CPCC 480097的鉴定
• 1.材料与方法
• 1.1.材料
• 1.1.1.菌种
• 1.1.2.主要试剂
• 1.1.3.主要仪器
• 1.1.4.培养基
• 1.2.方法
• 1.2.1.培养方法
• 1.2.2.菌种的纯化与复壮
• 1.2.3.溶液的配制
• 1.2.4.粗酶液的制备
• 1.2.5.抗凝活性的测定
• 1.2.6.形态学鉴定
• 1.2.7.氯化苄法提真菌染色体DNA
• 1.2.8.18S rDNA和ITS序列PCR
• 1.2.9.系统发育分析
• 2.结果与讨论
• 2.1.菌种纯化与复壮
• 2.2.CPCC 480097的鉴定
• 2.2.1.形态学鉴定
• 2.2.2.分子生物学鉴定
• 2.2.3.鉴定结果
• 3.结论
• 第三章 CPCC 480097发酵条件的初步优化
• 1.材料与方法
• 1.1.材料
• 1.1.1.菌种
• 1.1.2.主要试剂
• 1.1.3.主要仪器
• 1.1.4.培养基
• 1.2.方法
• 1.2.1.培养方法
• 1.2.2.粗酶液的制备
• 1.2.3.活性测定
• 1.2.4.缓冲液配制
• 1.2.5.胞内酶、胞外酶的判断
• 1.2.6.样品色素测定
• 1.2.7.pH测定
• 1.2.8.菌体生长曲线的制作
• 2.结果与讨论
• 2.1.胞内酶、胞外酶的判断
• 2.2.产孢培养基的考察
• 2.3.碳源的考察
• 2.4.碳源浓度的考察
• 2.5.氮源的考察
• 2.6.氮源浓度的考察
• 2.7.玉米粉与黄豆粉比列的考察
• 2.8.无机盐与微量元素的考察
• 2.9.发酵培养基初始pH的确定
• 2.10.最佳发酵培养基配方的确定
• 2.11.种子质量的考察
• 2.12.转种量的考察
• 2.13.装液量的考察
• 2.14.培养温度的考察
• 2.15.发酵过程曲线
• 2.16.最优发酵条件的确定
• 3.结论
• 第四章 HCCB00699S1的分离纯化与性质的初步研究
• 1.材料和方法
• 1.1.材料
• 1.1.1.主要试剂
• 1.1.2.主要仪器
• 1.2.方法
• 1.2.1.缓冲液的配制
• 1.2.2.粗酶液的制备
• 1.2.3.纤维蛋白平板测定法
• 1.2.4.蛋白含量的测定
• 1.2.5.SDS-PAGE
• 1.2.6.冷冻干燥
• 1.2.7.低温保存对粗酶稳定性影响试验
• 1.2.8.反复冻融对粗酶稳定性影响试验
• 1.2.9.工作温度对粗酶稳定性影响试验
• 1.2.10.pH对粗酶稳定性影响试验
• 1.2.11.硫酸铵、氯化钠对粗酶稳定性影响试验
• 1.2.12.粗酶的有机溶剂沉淀
• 1.2.13.粗酶的等电点沉淀
• 1.2.14.糖的定性检测
• 1.2.15.盐析
• 1.2.16.微滤
• 1.2.17.超滤
• 1.2.18.Sephadex 25脱盐柱脱盐
• 1.2.19.Mono-Q阴离子交换柱层析
• 1.2.20.Superdex 75凝胶柱过滤
• 1.2.21.纯酶比活的测定
• 1.2.22.纤维蛋白自显影
• 1.2.23.N-端氨基酸序列的测定
• 1.2.24.纯酶最适反应pH试验
• 1.2.25.纯酶最适反应温度试验
• 1.2.26.pH对纯酶稳定性影响试验
• 1.2.27.温度对纯酶稳定性影响试验
• 1.2.28.纯酶冻干粉耐热性试验
• 1.2.29.蛋白酶抑制剂对纯酶活性影响试验
• 2.结果与讨论
• 2.1.UK纤溶平板标准曲线
• 2.2.蛋白质浓度测定
• 2.3.粗酶性质的研究
• 2.3.1.低温保存对粗酶稳定性的影响
• 2.3.2.反复冻融对粗酶稳定性的影响
• 2.3.3.工作温度对粗酶稳定性的影响
• 2.3.4.pH对粗酶稳定性的影响
• 2.3.5.硫酸铵、氯化钠对粗酶稳定性的影响
• 2.3.6.有机溶剂沉淀
• 2.3.7.等电点沉淀
• 2.4.分离纯化
• 2.4.1.离心
• 2.4.2.盐析
• 2.4.3.微滤
• 2.4.4.超滤
• 2.4.5.脱盐
• 2.4.6.糖的定性检测
• 2.4.7.离子交换
• 2.4.8.凝胶过滤
• 2.4.9.分离体系的确立
• 2.4.10.纯化收率
• 2.5.基本参数的测定
• 2.5.1.比活的测定
• 2.5.2.纤维蛋白平板自显影
• 2.5.3.等电点的测定
• 2.5.4.N-端序列的测定
• 2.6.纯酶性质的初步研究
• 2.6.1.最适酶反应pH
• 2.6.2.最适酶反应温度
• 2.6.3.酶的pH稳定性
• 2.6.4.酶的温度稳定性
• 2.6.5.酶冻干粉的耐热性
• 2.6.6.蛋白酶抑制剂对酶活的影响
• 3.结论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢