论文摘要
神经细胞分化是一个复杂的过程,分化的各个阶段中都有特异的基因选择性表达。在这一过程中表观遗传调控（epigenetic regulation）发挥着重要作用。Neurogenin1（Ngn1）是碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loop-helix,bHLH）家族成员。在神经系统发育过程中,Ngn1在神经前体细胞（neuronal precursors）中被诱导表达。Ngn1能促进神经细胞分化,并抑制神经胶质细胞分化,是一种神经细胞分化过程中关键的调控蛋白。因此,研究ngn1基因在神经分化过程中被诱导激活的机制对神经发育和分化过程的认识具有重要意义。本论文以全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,atRA,简称RA）诱导小鼠胚胎瘤（embryonal carcinoma,EC）P19细胞作为神经分化的模型,探讨了ngn1表达激活的调控机制,特别是在染色质水平的表观遗传调控机制。1.RA诱导P19细胞神经分化模型的建立及对ngn1表达的检测以RA诱导培养P19细胞4天后,将细胞重新置于正常培养基中培养,细胞开始有神经元分化的趋势,逐渐呈现出类似于神经元的形态,并形成稀疏的网络。以神经分化的标志蛋白神经元特异的第三类微管蛋白β（neuron specific classⅢβ-tubulin,TuJ1）进行免疫荧光和Western免疫印迹检测发现,与正常培养的P19细胞相比,RA诱导后细胞中高表达TuJ1,反映出其神经细胞的特征。以定量RT-PCR检测发现ngn1mRNA在RA诱导2天后表达水平开始明显增加。利用染色质免疫沉淀（Chromatinimmunoprecipitation,ChIP）的方法检测RNA聚合酶Ⅱ（RNA PolⅡ）在基因组中ngn1基因区域结合情况发现,RA诱导后RNAPolⅡ在ngn1启动子区结合增加,ngn1基因由转录抑制状态转变为激活状态。利用RT-PCR、Western blot等方法检测到在P19细胞神经分化中多种表观遗传调控相关蛋白的表达发生明显变化,提示在这一过程中表观遗传调控可能发挥着重要的作用。2.RA诱导P19细胞染色质中ngn1基因区域核心组蛋白修饰变化组蛋白共价修饰可动态调节染色质的结构,对基因转录具有重要的调控作用。核小体核心组蛋白N端尾部以及核心区的多个氨基酸残基可发生乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化、SUMO化、ADP核糖基化等翻译后修饰。这些修饰可以改变核小体中组蛋白与DNA的相互作用,进而影响染色质的高级结构。我们使用ChIP的方法检测了ngn1基因上游调控区以及编码区相应的组蛋白修饰状态及其随RA诱导而在基因组序列上分布的变化。结果发现,在RA诱导后ngn1基因区域组蛋白H3K9乙酰化水平显著上升,并以转录起始点附近和外显子区最为显著;而H3K14的乙酰化水平在整个基因区域及上游调控区仅略有上升。另外,使用不同浓度Ⅰ类和Ⅱ类HDAC的抑制剂Trichostatin A（TSA）处理P19细胞后ngn1表达增加,并具有剂量依赖性。分别以TSA、RA或二者共同处理P19细胞,经不同时间后在RT-PCR检测中发现单独用TSA处理P19细胞可使ngn1表达增加,而用TSA和RA共同处理细胞时,结果与RA的处理结果相似。TSA处理使ngn1表达增加,提示组蛋白高度乙酰化在ngn1表达中具有促进作用。p300/CBP家族是一组受到广泛关注的组蛋白乙酰基转移酶（histoneacetyltransferases,HAT）,也是转录共激活因子,对核心组蛋白的乙酰化起重要作用。p300/CBP相关因子PCAF（p300/CBP associated factor）同样起到组蛋白乙酰基转移酶的作用。通过ChIP实验我们发现组蛋白乙酰基转移酶p300在RA诱导P19细胞前后在ngn1上持续结合。而PCAF在诱导2天后,开始结合于近端启动子区,提示其可能参与催化ngn1基因上组蛋白的乙酰化。组蛋白甲基化也是表观遗传的一个关键调控因素。组蛋白中特异的赖氨酸位点甲基化对于维持功能各异的染色质区域具有重要作用。利用ChIP技术检测P19细胞分化过程中ngn1基因及其调控区组蛋白H3K9、H3K27、H3K4的甲基化状态发现:H3K9双甲基化水平先降低后升高,而三甲基化水平无明显变化;H3K27三甲基化水平在诱导后迅速升高,然后逐渐降低;H3K4在诱导过程中逐步增加,在启动子近端区域和外显子区尤为明显。这些结果提示,组蛋白甲基化在ngn1表达激活过程中发挥重要作用。3.染色质重塑复合物SWI/SNF与RA诱导的ngn1基因活化依赖ATP的染色质重塑复合物利用ATP酶亚基水解ATP提供的能量,改变组蛋白与DNA间的相互位置,在靠近核心组蛋白的DNA表面建立特殊的构象,使DNA得以与转录因子接近,达到重塑染色质而调控基因转录的作用。哺乳动物SWI/SNF的核心ATPase亚基是Brg1或Brm,二者均能以依赖DNA的方式水解ATP,重塑核小体的结构。Brm在神经分化中的作用目前尚不清楚。在未诱导的P19细胞中,利用Western blot未能检测到Brm的表达。然而,在RA诱导后不仅Brm表达增加,ChIP实验还发现Brm在ngn1基因上结合增加,因此提示以Brm为核心亚基的SWI/SNF复合物可通过促进ngn1表达而参与RA诱导的P19细胞分化过程。4.转录因子Sox6可能参与调控ngn1的表达Sox（Sry-related High mobility group Box）蛋白是一类含有HMG盒DNA结合结构域的转录因子。其成员广泛参与胚胎发育和细胞命运决定的调控。利用生物信息学发现ngn1基因上游调控区具有3个潜在的Sox蛋白结合位点。Western blot检测显示,RA诱导后Sox6蛋白水平先增加后降低。利用EMSA和ChIP方法首次证明在RA诱导的P19细胞中Sox6可结合在ngn1基因调控区序列上。利用免疫共沉淀发现Sox6与PCAF之间存在相互作用。这些结果提示Sox6可能参与调控ngn1的表达。对ngn1基因相关的核心组蛋白中乙酰化和甲基化修饰变化的发现,不仅充实了ngn1基因表达调控机制,也为组蛋白密码提供了新证据。Brm的诱导表达及其在ngn1基因上的结合为Brm在神经细胞分化中的作用提供了新的线索。首次证明Sox6在ngn1启动子区的结合提示了Sox6蛋白在神经分化中的作用,并为Sox6促进P19细胞分化提供了可能的解释。对ngn1表达调控研究将进一步揭示神经细胞分化的表观遗传调控机制,并为治疗神经性疾病提供新的线索。