唐菖蒲弯孢霉漆酶产生、纯化及酶学性质研究

论文摘要

漆酶（EC 1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶,广泛分布于植物,真菌和细菌中。漆酶能催化降解许多有机和无机底物,在工业应用和生物修复等方面具有广泛的用途。本研究从黄花蒿植株中分离出一株具有漆酶活性的真菌Z-1,经ITS1-5.8S-ITS2rDNA区域的序列鉴定,与弯孢菌属中的唐菖蒲弯孢霉（Curvularia trifolii）的亲缘关系较近,同源性可达100%。通过单次单因素实验,确定了唐菖蒲弯孢霉合成漆酶的最佳培养条件:接种量1%、装液量60%（V/V）,摇床转速150 r/min,发酵液初始pH 7.0,培养温度29℃。对培养基成分的筛选表明外加有机氮源对唐菖蒲弯孢霉产漆酶的促进作用大于无机氮源的促进作用。确定最优碳源和氮源为葡萄糖和蛋白胨,诱导剂为愈创木酚。Plackett-Burman设计结果表明发酵产酶高峰期（发酵72h）氯化钙、硫酸锌和硫酸锰是主要影响因素。通过PEG浓缩,离子交换层析和凝胶过滤等纯化技术对Curvularia trifoli Z-1胞外漆酶进行了纯化。最终纯化倍数为2.90倍,总活力回收率为16.01%。以ABTS作为底物,Curvularia trifoli Z-1纯化后的漆酶的最适反应pH为2.6,在pH 2.4～3.2之间维持较高的酶活;30℃时,纯酶在pH 6.0～pH8.0的缓冲液中较稳定,而在pH 2.2～pH4.0范围内酶活就迅速下降。纯酶最适反应温度为40℃;在最适pH下研究漆酶对温度的稳定性发现45℃以下稳定。Curvularia trifoli Z-1漆酶的等电点通过批量层析测定为6.5。纯化后的漆酶能氧化不同的底物,包括ABTS和多种染料。Curvularia trifoli Z-1漆酶对茜素红,刚果红等5种染料的降解不需要小分子介质的参与且降解效果较好,在1000U/L的酶活下对茜素红降解70h,降解效率可达80%,显示了唐菖蒲弯孢霉菌株Z-1及其所产漆酶在染料降解上具有很强的应用潜力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 真菌漆酶概述
• 1.1.1 真菌漆酶的结构与性质
• 1.1.2 真菌漆酶的催化反应机理
• 1.1.3 真菌漆酶的作用底物
• 1.2 真菌漆酶的应用
• 1.2.1 环境修复
• 1.2.2 生物漂白和脱色
• 1.2.3 食品加工
• 1.2.4 绿色有机合成
• 1.2.5 生物检测
• 1.3 真菌漆酶的研究进展
• 1.3.1 真菌漆酶的产生种
• 1.3.2 真菌漆酶的基因的结构与表达调控
• 1.3.3 影响真菌漆酶合成的条件
• 1.4 本课题研究的目的和内容
• 2 漆酶高产菌株的筛选与鉴定
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试样品
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试验仪器和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 内生真菌的分离
• 2.2.2 丁香醛连氮法定性检定漆酶活性
• 2.2.3 ABTS法定量检测漆酶活性
• 2.2.4 菌株形态特征
• 2.2.5 菌株分子生物学分类鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌株的培养特征
• 2.3.2 菌体的形态学特征
• 2.3.3 Z-1菌株的分类地位
• 2.4 本章小结
• 3 唐菖蒲弯孢霉菌株Z-1合成漆酶的液体发酵条件优化
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验仪器
• 3.1.4 实验试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 发酵条件的筛选
• 3.2.2 培养基成分的优化
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 发酵条件的优化
• 3.3.2 培养基成分优化
• 3.4 优化前与优化后的产酶历程比较
• 3.5 本章小结
• 4 唐菖蒲弯孢霉菌株Z-1漆酶的分离纯化及酶学性质研究
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 药品
• 4.1.3 培养基
• 4.1.4 仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 培养方法
• 4.2.2 样品的制备
• 4.2.3 漆酶活性及蛋白含量的测定
• 4.2.4 纯化步骤
• 4.2.5 凝胶电泳
• 4.2.6 pH及温度对漆酶活性和稳定性的影响
• 4.2.7 漆酶等电点测定
• 4.2.8 漆酶对染料的脱色试验
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 漆酶纯化结果
• 4.3.2 pH及温度对漆酶活性和稳定性的影响
• 4.3.3 唐菖蒲弯孢霉漆酶等电点
• 4.3.4 染料脱色结果
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢