水稻OsGF14-c基因功能的初步分析

论文摘要

GF14是一类在高等植物的基本代谢﹑信号转导﹑抗逆以及转录调节等多种生理生化途径中发挥重要作用的基因。这类基因是14-3-3基因家族的成员,由于启动子结构中具有一个保守的G-Box元件而得名。我们根据该类基因的保守序列合成特异性探针,从水稻中花10号花的cDNA文库中筛选到一个基因,通过全长测序以及同源比较,发现它的核酸序列与NCBI数据库中注册的水稻GF14-c基因有高达99%的同源性,并在其上游启动子区也发现了一个保守的G-Box元件,从而确定该基因是水稻的GF14-c基因,我们把它命名为OsGF14-c。OsGF14-c的cDNA全长1154bp,编码256个氨基酸。序列分析表明该基因与酵母同源基因BMH2有71%的同源性,构建真核表达载体pdYES2,借助LiAC转化法将pdYES2导入BMH2缺陷型酵母菌株GG3000,筛选获得了补偿BMH2功能的重组酵母菌株PYGG。OsGF14-c基因的启动子区域具有一个典型的﹑高等植物特有的顺式作用元件G-Box元件,提示该基因可能与转录因子相互作用,洋葱表皮瞬时表达实验验证了OsGF14-c是核定位的。构建原核表达载体pGF-c2转化大肠杆菌XL1-Blue,筛选获得了表达GF14c-MBP融合蛋白的重组菌株,利用直链淀粉亲和层析纯化了OsGF14c-MBP融合蛋白。为了研究该基因在水稻的生长发育过程中所起的作用,我们以OsGF14-c基因的全长cDNA序列构建反义表达载体载体p35sCAMVF,并分别以OsGF14-c cDNA序列的特异区段以及保守区段构建了RNAi表达载体US和UT。将p35sCAMVF﹑US和UT借助农杆菌介导的转化分别导入水稻愈伤组织,培养成苗并进行遗传学分析。我们的工作对今后深入研究OsGF14-c基因的功能奠定了一定的基础。

论文目录

• 第一章 前言
• 1.1 14-3-3 基因的概述
• 1.1.1 14-3-3 基因的发现,命名以及最初的描述
• 1.1.2 14-3-3 基因生化功能的发现
• 1.1.3 14-3-3 基因生化功能的发现历史
• 1.2 14-3-3 基因的功能分析
• 1.2.1 14-3-3 蛋白在信号转导中的作用
• 1.2.1.1 14-3-3 蛋白与受体的相互作用
• 1.2.1.2 14-3-3 蛋白与激酶的相互作用
• 1.2.2 14-3-3 蛋白在细胞凋亡中的作用
• 1.2.3 14-3-3 蛋白在细胞周期中的作用
• 1.3 植物14-3-3 蛋白的研究进展
• 1.3.1 在种子萌发中的作用
• 1.3.2 基本代谢中的作用
• 1.3.3 14-3-3 蛋白在转录中的作用
• 1.3.4 14-3-3 蛋白同分异构体
• 1.4 酵母14-3-3 蛋白
• 1.5 14-3-3 基因的进化分析
• 1.6 14-3-3 蛋白的结构分析
• 1.7 小结
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株﹑质粒和实验用植物
• 2.1.2 主要仪器和试剂
• 2.1.3 实验中所用程序及软件
• 2.1.4 实验中设计合成的引物序列
• 2.1.5 常用培养基
• 2.1.5.1 LB 培养基
• 2.1.5.2 酵母YPD Plates
• 2.1.5.3 酵母SD-URA 筛选培养基（尿嘧啶缺陷）
• 2.1.5.4 酵母培养基MY
• 2.1.5.5 MS 培养基
• 2.1.5.6 水稻愈伤组织培养基NB 培养基的配制
• 2.1.5.7 农杆菌YEB 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 水稻cDNA 文库的筛选
• 2.2.1.1 制备筛选cDNA 文库的探针
• 2.2.1.2 杂交反应
• 2.2.2 质粒DNA 的提取和纯化（碱—SDS 法）
• 2.2.3 DNA 片断的回收
• 2.2.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.5 PCR 产物与载体的连接反应
• 2.2.6 大肠杆菌感受态细胞的转化
• 2.2.7 电击农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.2.8 共整合载体的构建
• 2.2.9 水稻的转化筛选技术
• 2.2.9.1 活化农杆菌
• 2.2.9.2 水稻的遗传转化
• 2.2.10 洋葱表皮的侵染与观察
• 2.2.11 水稻基因组DNA 的提取
• 2.2.12 SDS-PAGE 蛋白电泳
• 2.2.13 酵母的LiAC 转化
• 第三章 结果与分析
• 3.1 基因OsGF14-c 的克隆
• 3.2 基因OsGF14-c 的序列分析
• 3.2.1 OsGF14-c 的基因结构
• 3.2.2 基因OsGF14-c 的同源比对以及蛋白结合位点分析
• 3.2.3 基因OsGF14-c 的DNA 序列
• 3.2.4 转基因水稻的遗传学分析
• 3.2.5 OsGF14-c 基因的亚细胞定位分析
• 3.2.5.1 OsGF14-c 基因的瞬时表达
• 3.2.5.2 OsGF14-c 基因启动子的分析
• 3.2.6 原核表达以及蛋白纯化
• 3.2.6.1 原核表达载体的构建
• 3.2.6.2 SDS-PAGE 分析
• 3.2.6.3 融合蛋白MBP-GF14c 的纯化
• 3.2.7 OsGF14-c 与酵母同源基因BMH2 的同源比对
• 3.2.7.1 真核表达载体pdYE52 的构建以及检测
• 3.2.7.2 酵母表型观察
• 3.2.8 真核表达载体的构建
• 第四章 讨论
• 4.1 转基因遗传学分析
• 4.2 细胞亚细胞定位分析
• 4.3 酵母互补实验
• 4.4 原核表达
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历