大肠杆菌无细胞系统合成人β-防御素和艾滋病病毒蛋白的研究

论文摘要

近年来一种以外源mRNA或DNA为模板,通过在细胞抽提物的酶系中补充底物和能量物质来合成蛋白质的体外蛋白质合成系统越来越引起重视。与传统的体内系统相比,无细胞系统具有众多的优越性:1)反应简便,只需加入抽提物、DNA模板和各种必需的反应底物,就可以表达目的蛋白;2)可用于表达在体内系统中难于表达的蛋白质,如对细胞有毒害作用的抗菌肽和膜蛋白等;3)能够直接以PCR产物作为线性模板在微孔板上同时平行合成多种蛋白质,能够满足高通量药物筛选和蛋白质组学研究等的需要。 人β-防御素是近年来发现的具有广谱抗菌活性并在机体抵御外来微生物入侵中起防御作用的一类阳离子抗菌肽。有望成为解决致病菌耐药性问题的新型内源性抗生素,并被证明具有抑制艾滋病病毒复制的作用。 分别对从人体炎症皮肤组织中通过RT-PCR方法克隆获得的人β-防御素-2（HBD-2）人源基因、经密码子优化后的HBD-2人工合成基因构建了HBD-2的表达载体,得到了一系列不同密码子来源或带有不同融合标签的HBD-2的体外表达载体。 将不同密码子来源的HBD-2的表达载体在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中进行表达,对比实验结果表明,密码子优化后合成基因的蛋白质表达量与人源基因表达量相当。 进一步将带有不同融合标签（如硫氧化还原蛋白,trxA和绿色荧光蛋白,GFP）的HBD-2表达载体在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中进行表达研究。结果表明,融合标签的添加明显提高了HBD-2的表达量,其中trxA对HBD-2表达的促进作用最为明显。添加GFP融合标签的HBD-2基因的表达水平虽然略低于添加trxA融合标签的,但GFP融合标签有利于实时检测该融合蛋白的表达。在无细胞蛋白质合成系统中表达的融合蛋白可溶性高,避免了在大肠杆菌表达抗菌肽时易形成包涵体的难题。 比较了反应操作模式对无细胞系统中目标蛋白质表达水平的影响。研究表明,与间歇式操作（Batch）相比,连续交换式（CECF,Continuous Exchange Cell-free）无细胞反应方式能够明显提高目标蛋白质的表达水平,目标蛋白的表达量最高达到了2毫克/毫升。这主要是因为在CECF模式下,能够不断补充底物和能量,并同时移走抑制性副产物,从而大大延长了反应时间,提高了产物产量。 对无细胞系统表达的目标蛋白质（trxA-HBD-2）的分离纯化进行了研究,建立了一条高效分离目标蛋白质的纯化工艺,总收率达到50%,目标蛋白质纯度达到95.2%。所得产物经溴化氰（CNBr）消化后,采用固体平板扩散法进行抑菌活性的测定,测得结果具有明显抑菌活性。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 无细胞蛋白质合成系统的研究进展
• 1.1.1 引言
• 1.1.2 无细胞蛋白质合成系统的简介
• 1.1.3 无细胞系统中蛋白质合成的机理和优越性
• 1.1.4 常用无细胞抽提物的制备过程
• 1.1.5 无细胞系统中影响蛋白质合成的两个关健问题
• 1.1.6 无细胞蛋白质合成系统反应器的设计和操作方式
• 1.1.7 无细胞系统蛋白质合成技术的应用和前景
• 1.2 防御素
• 1.2.1 引言
• 1.2.2 人防御素的组织分布
• 1.2.3 人防御素的分子生物学特征
• 1.2.4 人防御素的抗菌活性及作用机理
• 1.2.5 人防御素的医学和药用价值及前景展望
• 1.2.6 基因工程生产人防御素
• 1.3 艾滋病治疗药及其研究进展
• 1.3.1 艾滋病
• 1.3.2 HIV的复制及整合机制
• 1.3.3 目前艾滋病治疗药及治疗机理
• 1.3.4 小结
• 1.4 本课题拟研究的内容
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒
• 2.1.2 大肠杆菌菌种
• 2.1.3 抗体
• 2.1.4 工具酶及试剂盒
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 主要仪器
• 2.2 实验及分析方法
• 2.2.1 分子克隆相关实验
• 2.2.2 菌体浓度测定
• 2.2.3 蛋白浓度测定
• 2.2.4 SDS-PAGE电泳
• 2.2.5 Western blotting 分析
• 2.2.6 GFP荧光强度测定
• 第三章 HBD-2表达载体的构建
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 hBD2，shBD2，trxA和 GFP基因的获得
• 3.3.2 重组质粒的构建
• 3.3.3 对构建好的载体进行鉴定
• 3.3.4 构建好的表达载体的图谱
• 3.3.5 人β-防御素-2在大肠杆菌中的表达
• 3.4 小结
• 第四章 大肠杆菌无细胞系统间歇反应合成 HBD-2
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验材料
• 4.2.2 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 在无细胞间歇模式反应体系中表达防御素蛋白
• 4.3.2 大肠杆菌无细胞系统合成可溶性目标蛋白的研究
• 4.3.3 无细胞系统中两种不同基因表达水平的比较
• 4.3.4 不同系列表达载体的目标蛋白表达水平的对比
• 4.4 小结
• 第五章 大肠杆菌无细胞系统连续交换式反应合成 HBD-2及产物的分离纯化
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 仪器与试剂
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 CECF模式下的无细胞反应
• 5.3.2 不同无细胞操作方式下蛋白质表达水平的比较
• 5.3.3 亲和层析分离融合蛋白
• 5.3.4 融合蛋白的脱盐
• 5.3.5 CNBr消化融合蛋白及 HBD-2的活性测定
• 5.4 小结
• 第六章 大肠杆菌无细胞系统表达 HBD-3,4
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 实验材料
• 6.2.2 实验方法
• 6.3 结果与讨论
• 6.3.1 采用PCR方法克隆trxA和 GFP基因
• 6.3.2 表达载体的构建
• 6.3.3 HBD-3，4目标蛋白的理论分子量
• 6.3.4 人β-防御素-3,4在无细胞系统间歇式反应模式下的表达
• 6.4 小结
• 第七章 大肠杆菌无细胞系统表达 HIV病毒蛋白的初探
• 7.1 引言
• 7.2 材料与方法
• 7.2.1 实验材料
• 7.2.2 实验方法
• 7.3 结果与讨论
• 7.3.1 HIV基因质粒表达模板的构建
• 7.3.2 HIV基因PCR模板的构建
• 7.3.3 HIV基因在大肠杆菌无细胞蛋白质合成系统中的表达
• 7.3.4 HIV两种基因（人源、合成）在无细胞系统中表达的比较
• 7.4 小结
• 第八章 大肠杆菌无细胞系统的构建
• 8.1 引言
• 8.2 材料与方法
• 8.2.1 实验材料
• 8.2.2 实验方法
• 8.3 结果与讨论
• 5.3.1 报导基因表达质粒的构建
• 8.3.2 A19生长曲线的测定
• 8.3.3 破碎压力对抽提物中蛋白质含量的影响
• 8.3.4 制备抽提物时离心力大小的摸索
• 8.3.5 对抑制表达的原因进行查找和确定
• 8.3.6 制备大肠杆菌抽提物过程中的透析步骤和保存方法的优化
• 8.3.7 底物和能量再生体系的优化
• 8.4 小结
• 第九章 结论和建议
• 9.1 结论
• 9.2 建议
• 致谢
• 发表论文及参加会议
• 参考文献