犬瘟热病毒的分离、鉴定及单克隆抗体的研制

论文摘要

犬瘟热（Canine distemper, CD）是犬或者其他易感动物感染犬瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）所引发的一种高度传染性和致病性疾病。目前,在我国由CDV引起的犬瘟热广泛流行,是危害养犬业最为严重的传染病之一。本研究根据CDV的细胞培养特性,采用异种病毒特异性血清阻断法,选用Vero细胞从犬二联弱毒活苗样品中分离获得一株犬瘟热（CDV）弱毒株。病毒在Vero细胞上传代培养后,能够引起细胞出现园缩、聚集、拉网、坏死等特征性的病变过程。病变细胞经RT-PCR鉴定CDV,结果显示阳性。病毒理化试验表明,56℃30min CDV可被灭活,pH7.0～8.0对病毒活性没有影响,pH4.0以下和pH10.0以上病毒活力大大降低。CDV有囊膜,氯仿处理可让其失去活性,病毒核酸型试验表明,CDV为RNA病毒,凝集试验显示,CDV不与鸡、猪、绵羊及兔红细胞发生凝集反应。经测定,该CDV弱毒株的毒价为10-6.25/mL TCID50。以CDV Onderstepoort毒株的细胞培养液经PEG沉淀法纯化浓缩后作为免疫原,免疫6-8周龄的BALB/c雌性小鼠。经过3次皮下注射免疫后,再进行尾静脉加强免疫,3d后处死小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0做融合。用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）法筛选能够分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。经过反复的亚克隆筛选,最后得到5杂交瘤细胞株,均能够稳定地分泌抗CDV的单克隆抗体。分别命名为：1G5、2D7、3B6、4C7和4G5。5株单抗对CDV均有较高的特异性,和犬腺病毒Ⅱ型、犬细小病毒之间没有交叉反应。间接免疫荧光试验结果显示,5株单抗和感染了CDV的Vero细胞均能发生反应。5株杂交瘤细胞的腹水效价分别为1G5>100x210、2D7>100×29、3B6>100×27、4C7>100×28、4G5>100×210,细胞培养上清效价为28-29。5株单克隆抗体重链均属于IgG 1,轻链均属于K链。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 综述
• 1 病原特征
• 1.1 CDV的理化特性
• 1.2 CDV的分子生物学特点
• 1.2.1 核蛋白基因和核蛋白（N）
• 1.2.2 磷蛋白基因和磷蛋白（P）
• 1.2.3 融合蛋白基因和融合蛋白（F）
• 1.2.4 基质蛋白基因和基质蛋白（M）
• 1.2.5 血凝蛋白基因和血凝素蛋白（H）
• 1.2.6 大蛋白基因和大蛋白（L）
• 2 流行病学
• 3 临床症状
• 4 犬瘟热病毒病的致病机理
• 5 CDV的实验室诊断
• 5.1 病毒的分离培养
• 5.2 电镜检查
• 5.3 包涵体检测
• 5.4 免疫荧光抗体（FA）染色法
• 5.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）
• 5.6 RT-PCR检测
• 6 本研究的目的与意义
• 第一章 犬瘟热病毒的分离与鉴定
• 1 材料
• 1.1 病毒来源
• 1.2 细胞
• 1.3 主要溶液配制
• 1.4 主要试剂
• 1.5 主要仪器及耗材
• 2 试验方法
• 2.1 样品的处理及病毒分离培养
• 2.2 病变样品的RT-PCR检测
• 2.2.1 引物的设计和合成
• 2.2.2 RNA的提取
• 2.2.3 反转录
• 2.2.4 PCR扩增
• 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3 细小病毒的PCR检查
• 2.3.1 引物的设计和合成
• 2.3.2 病变细胞DNA的提取
• 2.3.3 PCR扩增
• 2.3.4 琼脂糖凝胶电泳
• 2.4 血凝试验
• 2.4.1 红细胞悬液的制备
• 2.4.2 血凝实验
• 50)测定'>2.5 组织培养半数感染量(TCID₅₀)测定
• 2.6 病毒理化试验
• 2.6.1 病毒囊膜试验
• 2.6.2 病毒核酸型试验
• 2.6.3 病毒酸碱敏感试验
• 2.6.4 病毒温度敏感性试验
• 3 实验结果
• 3.1 分离病毒感染VERO细胞产生的细胞病变
• 3.2 CDV的RT-PCR检测
• 3.3 细小病毒的PCR检测
• 3.4 血凝试验
• 50'>3.5 病毒TCID₅₀
• 3.6 病毒的理化试验
• 3.6.1 病毒囊膜试验
• 3.6.2 病毒核酸型试验
• 3.6.3 病毒酸碱敏感试验
• 3.6.4 温度敏感性试验
• 4 讨论
• 第二章 抗犬瘟热病毒单克隆抗体的制备
• 1 材料
• 1.1 细胞系和病毒株
• 1.2 常用溶液配制
• 1.3 动物
• 1.4 主要试剂
• 1.6 主要仪器及耗材
• 2 方法
• 2.1 抗原的制备
• 2.2 动物免疫
• 2.3 融合
• 2.3.1 骨髓瘤细胞的准备
• 2.3.2 脾淋巴细胞的准备
• 2.3.3 饲养细胞的准备
• 2.3.4 细胞融合
• 2.4 最佳抗原包被浓度和抗体稀释度的确定
• 2.5 检测板的准备
• 2.6 杂交瘤细胞的检测及筛选
• 2.7 阳性杂交瘤细胞的亚克隆
• 2.8 腹水的制备
• 2.9 单抗特性的鉴定
• 2.9.1 单抗效价测定
• 2.9.2 单抗特异性鉴定
• 2.9.3 亚类鉴定
• 2.9.6 杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性鉴定
• 2.10 单抗的反应性
• 2.10.1 间接ELISA试验
• 2.10.2 间接免疫荧光试验
• 2.10.3 微量细胞培养中和试验
• 3 结果
• 3.1 杂交瘤细胞株的建立
• 3.2 单抗腹水效价测定
• 3.3 单抗特异性鉴定
• 3.4 亚类鉴定
• 3.5 杂交瘤分泌抗体的稳定性
• 3.6 单抗的反应性
• 3.6.1 间接ELISA试验
• 3.6.2 间接免疫荧光试验
• 3.7 微量细胞培养中和试验
• 4 讨论
• 参考文献
• 致谢