论文摘要
脑膜炎奈瑟双球菌（Neisseria Meningitidis）是唯一能引起全球性细菌性脑膜炎大规模流行的细菌,疫苗接种是用于预防的主要手段,但是传统的多糖疫苗产生抗体能力不足,对2岁以下的婴幼儿更无法产生保护作用。实验证明用细菌多糖和蛋白载体通过化学方法制备的结合疫苗,能有效克服多糖疫苗免疫时的各种缺点,诱导产生细胞免疫和加强免疫应答,并且对所有年龄组的人群都能够提供免疫保护作用。现在国内上市的结合疫苗大都使用破伤风类毒素作为载体,但其具有一定的局限性,可能会出现毒性回复或是产生载体抑制效应等问题,所以寻找安全、有效的载体是结合疫苗领域的课题之一。流感嗜血杆菌D蛋白具有良好的免疫原性和安全性,并且作为疫苗载体己应用于十价的肺炎结合苗中,在国外上市。目前,国内尚没有以D蛋白为载体疫苗的相关报道。本文通过对b型流感嗜血杆菌D蛋白基因进行扩增,构建重组质粒pET30a/hpd并转化进入大肠杆菌DH5a中,经筛选保存阳性克隆菌,再转化入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导,并使重组D蛋白以包涵体形式表达,表达量约占菌体总蛋白的40%；经一步过柱纯化可得到纯度达95%的重组D蛋白。本文采用CDAP法活化A群和C群脑膜炎多糖（GAMP和GCMP）,在三乙胺存在的条件下,制备A群和C群脑膜炎多糖和D蛋白结合物,并通过Sepharose 4FF柱层析,对结合物组分进行多糖和蛋白含量的测定。本文将GAMP, GCMP, GAMP-D, GCMP-D, GAMP+D和GCMP+D混合物分别经皮下免疫接种Balb/c小鼠,通过间接ELISA法测定小鼠体内A群和C群脑膜炎球菌多糖特异的IgG, IgG1, IgG2a抗体水平,结果表明接种后结合物诱生的多糖特异性IgG, IgG1, IgG2a抗体水平显著高于不结合组,初步证明重组D蛋白能够起到载体的作用。本研究采用分子克隆技术获得了能够产生重组D蛋白的菌株,并将纯化的重组蛋白作为载体与A群和C群脑膜炎球菌多糖结合,动物实验证明结合物具有良好的免疫原性,为进一步以重组D蛋白为载体制备其它结合疫苗奠定了基础。
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摘要ABSTRACT目录第一章 前言1 引言2 b型流感嗜血杆菌D蛋白2.1 流感嗜血杆菌2.2 流感嗜血杆菌D蛋白3 CDAP活化法4 脑膜炎球菌的流行病学5 脑膜炎球菌疫苗5.1 脑膜炎多糖疫苗（MPV）5.2 脑膜炎球菌结合疫苗（MCV）6 本研究的目的和意义7 技术路线第二章 b型流感嗜血杆菌D蛋白的克隆、表达和纯化1 材料与仪器1.1 材料1.2 菌株和质粒1.3 主要试剂1.4 实验动物1.5 主要试剂的配制2 实验方法2.1 b型流感嗜血杆菌CMCC58547菌株全基因组DNA的制备2.2 b型流感嗜血杆菌hpd基因的克隆2.3 b型流感嗜血杆菌hpd基因的原核表达2.4 重组蛋白D的纯化2.5 b型流感嗜血杆菌抗血清的制备2.6 间接ELISA法检测抗血清的抗体滴度2.7 重组蛋白D的Western Blot分析3 结果3.1 b型流感嗜血杆菌hpd基因的克隆3.2 pET30-hpd重组质粒的阳性鉴定3.3 hpd基因的序列比对3.4 重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达及存在形式3.5 重组蛋白表达的优化3.6 DEAE弱阴离子柱纯化重组蛋白D3.7 浓缩前后重组蛋白D浓度3.8 b型流感嗜血杆菌抗血清elisa结果3.9 重组蛋白D的Western Blot鉴定结果4 讨论4.1 重组D蛋白的表达4.2 表达形式和条件的选择4.3 目的蛋白的纯化4.4 重组D蛋白的鉴定第三章 A、C群脑膜炎多糖-重组D蛋白结合物的制备及免疫原性初步研究1 材料与仪器1.1 实验仪器1.2 主要试剂1.3 主要溶液的配制1.4 实验动物2 实验方法2.1 A群脑膜炎多糖的活化2.2 C群脑膜炎多糖的活化2.3 A群脑膜炎多糖的活化-重组D蛋白结合物的制备2.4 C群脑膜炎多糖的活化-重组D蛋白结合物的制备2.5 A群和C群脑膜炎多糖-重组D蛋白结合物的纯化2.6 A群和C群脑膜炎多糖的活化-重组D蛋白结合物理化性质测定2.7 A群和C群脑膜炎多糖-D蛋白结合物的免疫原性分析3 结果3.1 A群和C群脑膜炎多糖重组D蛋白结合物的理化性质3.2 结合物的免疫原性分析4 讨论4.1 脑膜炎多糖和重组D蛋白的结合4.2 结合物的动物免疫原性第四章 结论与展望1 结论2 展望参考文献附录硕士期间发表文章致谢
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标签：型流感嗜血杆菌蛋白论文; 原核表达论文; 蛋白载体论文; 脑膜炎球菌论文; 结合疫苗论文;
b型流感嗜血杆菌D蛋白的克隆、表达、纯化及作为结合疫苗载体的初步研究
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