论文摘要
上世纪90年代中期以来,抗体药物在新药中崭露头角。在治疗性应用中,全人抗体可以克服鼠源单克隆抗体在临床应用中的缺点:如诱发人体产生人抗小鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA）反应、在人体内半衰期短、不能够有效地激活CDC及ADCC等。噬菌体展示抗体库技术是获取全人抗体的最主要手段之一。能否从库中筛选出针对任意抗原的特异性抗体,抗体库库容是主要的决定因素。此外,筛选出抗体亲和力大小和库容密切相关。因此,本研究尝试通过分子生物学技术,经Cre/LoxP定位重组系统构建超大容量天然噬菌体抗体库,并对筛选中得到的抗DR5抗体在原核、真核系统中表达,对表达抗体的抗原结合等特性进行了初步研究。1人源天然噬菌体抗体库的建立、筛选从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞（>180份）,提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因（VH和VL）,通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-BLUE细菌得到ScFv初级抗体库。以高感染复数（MOI>100:1）感染Cre +菌株BS1365,利用Cre/LoxP位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数（MOI<1:1）感染XL1-BLUE,获取次级工作库。结果表明:抗体V区基因得到有效扩增,初级库库容3.6×107,工作库库容1.8×1011,经Cre/LoxP定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库;分别用人B淋巴细胞刺激因子（Blys）、人死亡受体胞外段（DR5）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、白细胞介素6（IL-6）以及蓖麻毒素（Ricin）等5种不同抗原进行筛选均得到特异性结合的噬菌体抗体,测序结果进一步表明,所获取抗体基因涵盖了不同的基因亚群,证明该抗体库具有良好的多样性,可用于制备人源抗体。2在原核、真核系统中表达的抗DR5抗体的抗原结合等特性的初步研究为了降低试验费用,缩短实验周期,借助生物信息学理论及计算机辅助分子模拟技术,通过多序列比对分析、抗体Fv构象稳定性分析,对抗体库中筛选出来的抗DR5单克隆抗体进行了合理性评估。结合筛选过程中的特异性结合实验结果,以抗体可变区构象稳定性、结合能力、出现频率为判据选取C11、B2、A2、A8共四株噬菌体抗体进行生物学实验。将四株噬菌体抗体以ScFv形式插入pET28a原核表达载体,转化BL21菌株后表达重组人ScFv抗体。试验结果表明ScFv抗体分子得到有效表达;此外,超声破碎后的表达上清,经ELISA、Western Blot试验证实:表达的ScFv抗体蛋白可以和预先纯化的DR5抗原特异性结合,证明了抗体库筛选得到的ScFv抗体具有特异性识别重组人DR5胞外区蛋白的活性。将四株噬菌体抗体的轻、重链可变区基因,插入到真核表达载体pCMV-Express中,等量瞬时转染293T细胞,表达完整的抗体分子。Western blot试验证实,表达上清中存在能被山羊抗人IgG酶标抗体特异性识别,且分子量与IgG标准品一致的人全分子抗体;并且表达抗体可特异性识别转印在NC膜上的DR5抗原;竞争ELISA结果显示,表达抗体与DR5的天然配体TRAIL存在竞争关系,其结合力随TRAIL剂量增加而下降。
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标签：天然噬菌体抗体库论文; 人源抗体论文; 抗体论文;