小麦黄色素合成途径中Psy基因的克隆与分子特性及黄色素含量DH群体的构建

论文摘要

长期以来,我国人民对面粉及面制食品的色泽要求很高。普通小麦（Ttiticumaestivum L.2n=6x=AABBDD）籽粒黄色素含量（Yellow Pigment Content,YPC）是造成面粉色泽降低的重要因素之一,而且YPC对蒸煮面食品的色泽以及小麦的营养品质等均具有显著影响。虽然YPC受环境因素的影响,但基因型是其主要决定因素。黄色素是由多种物质组成的混合物,其主要成分是类胡萝卜素,类胡萝卜素的生物合成是在八氢番茄红素合成酶（Phytoene synthase,Psy）的作用下进行的,此酶为类胡萝卜素生物合成途径中的首要限速酶（Primary Rate-limiting Enzyme,PRH）,其基因也是类胡萝卜素基因操作的首选基因,其他作物（尤其是玉米）中对Pay基因的研究已较为深入,但对普通小麦Psy基因的研究还未开展。本研究以已经发表的玉米Psy基因为基础,从YPC差异显著的中国小麦品种（系）中克隆普通小麦Psy基因,并进行分子特性和YPC分析;同时选择YPC差异显著的小麦品种组配F1与玉米远缘杂交,诱导可进行黄色素含量遗传分析的小麦双单倍体（Double Haploid,DH）群体,旨在明确Psy基因对小麦YPC的影响、开发小麦YPC的分子标记,同时为小麦YPC的遗传分析、高（低）YPC小麦新品种的选育提供遗传材料和新种质。主要结果如下:1.小麦黄色素合成途径中Pay基因的克隆及分子特性利用玉米Pay基因和小麦EST序列设计引物克隆小麦Pay基因并测序,同时和玉米Pay基因进行序列比对分析。结果表明,5对引物Psy01、Psy03～Psy06在YPC不同的小麦样品中分别扩增出989bp、785 bp、1192 bp、690 bp和302 bp的5条带,同一引物在不同YPC品种中的PCR产物序列一致,经比对分析,5条序列均为Pay基因（片段）,并由此组装成一条全长3437bp、包括6个外显子和5个内含子的小麦Psy基因。文中以引物Psy04为例对其扩增的PCR产物进行了详细的分子特性分析。2.小麦Pay基因的等位变异及其对黄色素含量的影响根据已发表的麦族植物Pay基因序列的保守区设计引物Psy02,克隆小麦Psy基因。结果表明,该引物下PCR产物出现3种带型:196bp、233bp和489bp,其中196bp和233bp条带涵盖了小麦Psy基因第2外显子全部序列,相差的37bp为Psy基因第2内含子中的一段插入序列,可反映不同YPC,属小麦Pay基因的等位变异。验证试验表明,248份试材（包括229份中国小麦微核心种质和19份品质性状典型的小麦品种）中有153份材料（占样品数的65.7%）扩增出196bp条带,群体内YPC均值7.314mg/kg,属高YPC范畴;另有95份材料（占样品总数的38.3%）扩增出233bp条带,群体内YPC均值为5.207mg/kg,属低YPC范畴,方差分析表明二者YPC差异达1%极显著水平差异,说明上述37bp的插入序列是导致小麦品种间YPC产生差异的原因之一,因此该引物扩增的Psy基因对小麦YPC具有显著影响,引物Psy02是对小麦YPC进行分子鉴定的重要标记。序列分析表明,196bp和233bp与设计引物的探针序列100%同源,489bp序列的BLAST搜索显示,与序列EU096094（未定位）的同源率最高,达97%,与7A染色体上序列EF600063和7B染色体上序列DQ642439的同源率均为85%,表明该基因片段可能为7A和7B染色体以外的另一Psy基因。结合该序列对应小麦品种的高YPC,推测该基因和7A染色体的Psy基因对黄色素含量存在积加效应。3.普通小麦DD染色体上Psy基因的发现及其等位变异以扩增小麦Psy基因的相应引物Psy01～Psy06,在节节麦（2X=DD=14）中进行PCR反应。结果表明,仅引物Psy02和Psy06能扩增出特异条带。引物Psy02的扩增产物长206bp,与普通小麦中扩增的196bp序列同源率为93.0%,对应的第2外显子区域内仅有1SNP;引物Psy06的PCR产物长305bp,与普通小麦中扩增的302bp序列同源率达95.77%,对应的第6外显子区域内无SNP,说明在小麦DD染色组中存在Psy基因,同时也排除了将引物Psy01、Psy03、Psy04、Psy05的扩增产物和引物Psy02的489bp扩增产物定位于D染色体的可能。4.小麦黄色素含量DH群体的构建为获得一定规模的小麦单倍体以构建小麦黄色素含量的DH群体,用高/低YPC小麦品种组配F1,F1再和玉米远缘杂交诱导小麦单倍体,研究了环境温度对单倍体成胚率、幼胚取材时期、幼胚大小、4℃处理时间、暗处理时间对单倍体成苗率的影响。结果表明,获得最高成胚率的环境温度为21～23℃,授粉后12～16天取材的幼胚成苗率无明显差异;0.5～1.0mm大小的幼胚成苗率显著高于0～0.5mm和1.0～1.5mm大小的幼胚成苗率;1～3天短期4℃处理对胚萌发具有一定促进作用,但处理3天后,出愈率和成苗率都将降低;胚培养过程中12天左右的24h暗处理能有效提高成苗率,在此基础上建立了一套高效、可靠、重复性好的小麦×玉米单倍体诱导系统。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 黄色素的生物学特性
• 1.1 黄色素的主要成分
• 1.2 类胡萝卜素（黄色素）的生物合成
• 1.3 类胡萝卜素（黄色素）的重要生物学功能
• 1.4 类胡萝卜素生物合成途径中的关键酶八氢番茄红素合成酶Psy基因研究
• 2 小麦黄色素研究进展
• 2.1 小麦籽粒中黄色素的存在
• 2.2 小麦籽粒中黄色素对面粉色泽的影响
• 2.3 小麦籽粒黄色素的测定方法
• 2.4 与小麦黄色素含量相关的遗传学基础研究
• 2.5 小麦黄色素合成中关键酶基因Psy的基因定位
• 2.6 小麦黄色素含量的遗传育种研究
• 2.7 构建双单倍体DH群体对小麦黄色素含量遗传研究的意义
• 3 构建小麦双单倍体DH群体研究进展
• 3.1 单倍体胚的产生
• 3.2 单倍体植株的形成
• 3.3 单倍体植株的染色体人工加倍
• 3.4 单倍体的应用
• 4 研究内容和研究意义
• 第二章 小麦黄色素合成途径中Psy基因的克隆及分子特性
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 小麦Psy基因部分片段的克隆
• 2.2 小麦Psy基因序列的分子特征
• 2.3 小麦Psy基因编码的氨基酸序列分析
• 2.4 Psy基因的进化分析
• 3 讨论
• 第三章 小麦Psy基因的等位变异及对黄色素含量的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 小麦籽粒黄色素含量的变异及分布
• 2.2 引物Psy02的PCR扩增结果
• 2.3 引物Psy02扩增产物的序列分析及Psy基因的等位变异
• 2.4 7A和7B染色体外的Psy基因
• 2.5 Psy02引物在核心种质中的稳定性及对YPC进行分子鉴定的应用
• 3 讨论
• 第四章 利用节节麦（2X=DD=14）鉴定Psy基因及其等位变异
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 节节麦的表型特征和细胞学鉴定
• 2.2 引物Psy01、Psyr03、Psy04和Psy05的PCR扩增结果
• 2.3 引物Psy02的PCR扩增结果和序列分析
• 2.4 引物Psy06的PCR扩增结果
• 3 讨论
• 第五章 小麦黄色素含量DH群体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 亲本材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 不同环境温度对诱导单倍体的影响
• 2.2 幼胚取材时期对单倍体成苗的影响
• 2.3 幼胚大小对单倍体成苗的影响
• 2.4 4℃下不同处理时间对单倍体成苗的影响
• 2.5 不同暗处理时间对单倍体成苗的影响
• 2.6 单倍体的表型鉴定
• 2.7 单倍体的细胞学鉴定
• 2.8 用于小麦黄色素遗传研究的双单倍体DH群体的构建
• 3 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 附表