刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达及其ELISA检测方法的建立

论文摘要

弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性细胞内寄生的医学原虫,能感染几乎所有恒温动物（包括人类）,引起弓形虫病。在免疫功能正常的宿主体内通常形成包囊,造成隐性感染;但当宿主免疫功能下降时（如肿瘤患者、器官移植者及AIDS患者等）,弓形虫可在宿主体内播散引起弓形虫病甚至导致宿主死亡。弓形虫感染也是家畜家禽流产、畸胎、死产的主要原因之一,对畜牧业生产危害严重。刚地弓形虫膜表面蛋白1（SAG1）是弓形虫速殖子期特异性抗原,能够诱导机体产生IgG、IgM、IgA抗体和CD8+T细胞杀伤弓形虫。已有研究表明,弓形虫的主要表面抗原1具有很强的免疫原性,是弓形虫诊断和疫苗研究的重要候选抗原分子。SAG1抗原在原虫含量较低,因此用基因工程技术在体外表达P30蛋白,然后利用该蛋白作抗原,建立刚地弓形虫ELISA抗体检测方法。本实验参考Genbank登录的刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）P30全基因序列,设计合成一对引物,通过PCR在刚地弓形虫的基因组DNA中扩增出P30的相应片段,然后构建T-A克隆,经PCR扩增和酶切鉴定后进行测序。再亚克隆到原核表达载体pET-32a（+）中,构建了重组质粒pET-32a（+）/P30并转化DH5α感受态细胞,于含有氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆,再经PCR扩增和酶切鉴定重组质粒。然后将重组质粒pET-32a（+）/P30转化表达菌BL21（DE3）,用IPTG诱导成功表达出分子量为48.3kDa的融合蛋白,经Western-blotting鉴定目的蛋白具有良好的免疫学活性,为研究重组蛋白的免疫原性奠定了基础。重组T.gondii P30蛋白经过镍柱纯化后,作为抗原包被聚苯乙烯微量反应板,初步建立了猪弓形虫抗体的间接ELISA检测方法。对ELISA的最佳反应条件进行优化,结果表明T.gondii P30蛋白抗原的最适包被浓度为2.75μg/ml,最适封闭液为5%脱脂乳,检测血清稀释度为1:640,抗原和抗体的作用时间为1h,HRP-兔抗猪IgG的最适工作浓度为1:2000,最佳显色时间为15min,用2M H2SO4为终止液,确定阴阳性的临界值为0.384。包被的重组蛋白均不与猪瘟、猪蓝耳、猪圆环病的阳性血清发生交叉反应;用此建立的ELISA方法与IHA方法符合率达90.17%;表明建立的ELISA诊断方法具有良好的特异性和稳定性。本研究建立的间接ELISA方法,为试剂盒的研制与开发奠定了前期工作基础,并为我国进行猪弓形虫病的诊断与血清学监测和调查提供了一种技术手段。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 弓形虫的发现史
• 2 弓形虫的病原学与生活史
• 3 弓形虫的P30 蛋白研究进展
• 3.1 P30 蛋白的鉴定及结构特点
• 3.2 P30 蛋白的免疫作用
• 3.3 P30 蛋白的免疫学特点
• 3.4 P30 抗原的分子生物学研究
• 3.5 P30 在弓形虫入侵宿主细胞过程中的作用
• 4 弓形虫病的诊断方法
• 4.1 病原学诊断
• 4.2 血清学诊断
• 4.3 分子生物学诊断研究进展
• 5 猪弓形虫NT 株与NTA 株
• 6 本研究的目的及意义
• 试验一 刚地弓形虫NT 株P30 基因的克隆与表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 T.GONDII P30 基因片段PCR 扩增
• 2.2 T/A 克隆的鉴定
• 2.3 重组质粒PET-32A（+）/P30 的鉴定
• 2.4 重组蛋白的SDS-PAGE 结果
• 2.5 表达产物产量的扫描分析
• 2.6 重组蛋白的存在状态分析
• 2.7 重组蛋白的表达条件的优化
• 2.8 重组蛋白的纯化结果
• 2.9 重组蛋白的免疫印迹分析
• 3 讨论
• 试验二 刚地弓形虫抗体ELISA 检测方法的初步建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 间接ELISA 与间接血凝试验的比较
• 2 结果
• 2.1 重组蛋白浓度的测定
• 2.2 ELISA 反应条件的优化
• 2.3 阴阳性临界值的判定
• 2.4 特异性试验
• 2.5 重复性试验
• 2.6 包被板的保存期测定
• 2.7 间接ELISA 检测程序
• 2.8 间接ELISA 与间接血凝试验的比较
• 3 讨论
• 3.1 间接ELISA
• 3.2 间接ELISA 实验条件的摸索
• 3.3 用建立的间接ELISA 方法进行样品血清阴阳性的判定
• 3.4 ELISA 与IHA 两种检测方法符合率的比较
• 全文小结
• 致谢
• 参考文献