一种基于锚定PCR的微卫星筛选新方法的研究

论文摘要

微卫星是一种广泛应用的遗传标记。随着研究的不断深入，要求从基因组中大量筛选微卫星位点。传统的筛选方法虽然被普遍采用，但仍存在着许多缺点和不足，如需要构建基因文库、内切酶的使用以及筛选出的位点重复率高等。文库构建耗时、费力，且对技术、经验要求较高；由于内切酶切点分布的随机性，许多微卫星位点克隆中仅保留极少部分侧翼序列，因而无法设计引物；重复率高耗费了大量的经费和劳动力。本研究创建了一种基于锚定PCR的筛选方法，从东北虎基因组中筛选了大量的微卫星位点，有效克服了上述问题。首先进行一个单引物PCR，在微卫星重复区内设计单引物Str-ACN，并在引物3’末端锚定一个碱基。然后利用末端脱氧核糖核酸转移酶在PCR产物的3’末端上加一poly-C结构。再利用另行设计的引物GG-N与Str-ACN配对进行双引物扩增，扩增产物克隆测序后，得到的就是微卫星位点的下游序列。根据此下游序列再设计一个引物Nest1，利用相同的原理向上游扩增，克隆测序得到上游序列，这样就得到了完整的微卫星位点。最终本研究通过这种筛选方法，在第一次克隆测序的149个样品中共得到147个不同的微卫星位点的下游序列。从中随机抽取26个微卫星位点用于上游序列的扩增和测序，共得到24个完整的微卫星位点。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 微卫星DNA
• 1.1.1 微卫星的发现
• 1.1.2 微卫星的结构与分类
• 1.1.3 微卫星的分布
• 1.1.4 微卫星的特点
• 1.1.5 微卫星的多态性机理
• 1.1.6 微卫星的生物学功能
• 1.2 微卫星的应用
• 1.2.1 构建DNA指纹图
• 1.2.2 构建基因图谱
• 1.2.3 数量性状位点（QTL）定位
• 1.2.4 亲权鉴定与品系鉴定
• 1.2.5 群体遗传多样性的研究
• 1.2.6 遗传病的预测及诊断
• 1.2.7 濒危动物的保护
• 1.3 微卫星的获得
• 1.3.1 从公共数据库中查找微卫星位点
• 1.3.2 从相近物种获得微卫星引物
• 1.3.3 从基因组 DNA中筛选微卫星位点
• 1.4 本研究的意义
• 2 材料、原理与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验原理
• 2.2.1 第一轮锚定PCR扩增
• 2.2.2 第二轮巢式PCR扩增
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 DNA提取
• 2.3.2 DNA浓度测定
• 2.3.3 3’端侧翼序列的获得
• 2.3.4 5’端侧翼序列的获得
• 3 结果
• 3.1 DNA提取的结果
• 3.2 双引物扩增、回收的检测结果
• 3.3 一次克隆检测的结果
• 3.4 二次克隆检测的结果
• 3.5 3’侧翼序列的测定结果
• 3.6 5’侧翼序列的测定结果
• 3.7 可用位点的分析结果
• 4 讨论
• 4.1 本方法的优越性
• 4.1.1 无需使用内切酶
• 4.1.2 筛选位点的重复率低
• 4.1.3 无需杂交富集
• 4.2 本方法应用时需要注意的问题
• 4.2.1 基因组 DNA的质量
• 4.2.2 单引物的设计
• 4.2.3 PCR产物检测
• 4.2.4 阳性克隆的检测
• 4.2.5 出现的RAPD类似产物
• 4.3 本方法需要继续完善的问题
• 4.4 分离策略的最优化
• 4.5 微卫星位点多态性评价
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢