玉米盐诱导蛋白激酶基因ZmPti1、ZmSPK1和ZmASK1的克隆及功能分析

论文摘要

蛋白激酶在植物的抗盐途径中起到了非常重要的作用。我们以拟南芥和水稻的数据库中参与盐胁迫信号的蛋白激酶基因序列为信息探针，通过同源克隆的方法，从玉米中克隆了3个受盐胁迫诱导的蛋白激酶基因，对这3个蛋白激酶的序列进行了分析，并对其在抗盐途径中的作用做了研究。 通过RT-PCR的方法从玉米中克隆到一个受高盐诱导的全长cDNA，其编码一个与Ptil同源的蛋白，命名为ZmPtil。在酵母中表达ZmPtil蛋白，蛋白经过ProBond Resin进行纯化，并对纯化的蛋白进行自我磷酸化活性分析。磷酸化分析试验表明ZmPtil蛋白具有磷酸化活性。半定量RT-PCR分析结果显示ZmPtil基因的表达可以被水杨酸（SA）、低温、甘露醇和盐所诱导，但是不被脱落酸（ABA）所诱导。另外，在玉米不同的组织器官中ZmPtil基因的表达模式也不同。这些结果表明ZmPtil编码了一个新的Ptil-like激酶，并且可能同时参与了生物逆境和非生物逆境的信号传导过程，同时也很有可能参与了植物发育过程的调控。 为了进一步验证ZmPtil的生物学功能，我们在拟南芥中过量表达了ZmPtil基因。随后的分析结果表明，与对照相比，转基因株系的抗病性和抗冷、抗旱性没有明显的提高，但是抗盐性得到了明显的提高。在高盐胁迫下转基因植株的生长状态得到了改善；相对生物量、经济产量都得到了提高。生理生化分析表明，在盐胁迫下转基因株系相对于对照的SOD活性明显提高；MDA含量和外渗电导率则显著降低。 同样通过RT-PCR的方法，一个被高盐诱导的全长的cDNA被克隆，命名为ZmSPK1（for stress-induced protein kinase）。序列分析表明，此cDNA编码一个与SnRK2b同源的蛋白。生物信息学分析表明ZmSPK1蛋白含有364个氨基酸，估计分子量为41.8KD，等电点为5.8。进化树分析表明，推测的蛋白质序列与SnRK2b组蛋白成员序列的一致性最高。在酵母中表达ZmSPK1蛋白，表达的蛋白经过ProBond Resin纯化后用来做磷酸化活性分析，磷酸化分析结果表明ZmSPK1具有激酶活性。半定量RT-PCR分析表明ZmSPK1的表达可以被甘露醇、盐和ABA所诱导。另外，在玉米不同组织器官中，ZmSPK1显示不同的表达模式，在生殖器官中表达量最高。这些结果表明，ZmSPK1可以编码一个有功能的蛋白激酶，可能在非生物胁迫中起到一定作用，同时也可能参与了植物的生殖发育过程的调节。

论文目录

• 原创性声明
• 学位论文版权使用授权书
• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献综述
• 一 盐胁迫对植物生长的影响
• 二 植物适应盐胁迫的机理
• 三 蛋白激酶在植物抗盐信号传导中的作用
• 1 蛋白激酶的结构
• 2 蛋白激酶家族的分类
• 3 植物中参与抗盐信号途径的蛋白激酶
• 3.1 钙依赖而钙调素不依赖的蛋白激酶（CDPK）
• 3.2 SNF1-相关蛋白激酶（sucrose non-fermenting-1-related Protein kinase,SnRK）
• 3.2.1 植物中的SnRK1亚家族
• 3.2.2 植物中的SnRK2亚家族
• 3.2.3 植物中的SnRK3亚家族
• 3.3 促分裂原活化蛋白质激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）
• 3.4 其他类型的蛋白激酶
• 3.4.1 植物类糖原合酶激酶（Glycogen synthase kinase 3,GSK-3）
• 3.4.2 受体蛋白激酶（receptor protein kinase,RPK）
• 3.4.3 核糖体蛋白激酶（ribosomal-protein kinase）
• 3.4.4 转录调控蛋白激酶（transcription-regulation protein kinase）
• 四 本研究的目的和意义
• 第一部分 玉米抗盐胁迫基因ZmPti1的克隆、序列分析及功能验证
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 1 试验材料和试剂
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 菌种与质粒
• 1.2 主要分子生物学试剂
• 2 试验方法
• 2.1 玉米幼苗的培养及处理
• 2.2 玉米总RNA的提取
• 2.3 RT-PCR扩增玉米ZmPti1基因
• 2.3.1 第一链的反转录
• 2.3.2 PCR扩增
• 2.3.3 PCR扩增产物的回收
• 2.3.4 PCR扩增产物与pGEM-T载体的连接
• 2法制备大肠杆菌感受态'>2.3.5 CaCl₂法制备大肠杆菌感受态
• 2.3.6 pGEM-T载体连接体系的转化（热击法）
• 2.3.7 质粒DNA的提取
• 2.3.8 质粒DNA酶切验证
• 2.3.9 DNA测序
• 2.4 ZmPti1蛋白的酵母表达及活性检测
• 2.4.1 ZmPti1酵母表达载体的构建
• 2.4.2 酵母细胞感受态制备及转化
• 2.4.3 酵母质粒DNA的提取
• 2.4.4 ZmPti1基因在酵母中的表达
• 2.4.5 ZmPti1的蛋白质免疫印迹分析
• 2.4.6 含有His-tag的表达蛋白的纯化
• 2.4.7 溶液中ZmPti1蛋白的激酶活性检测
• 2.5 ZmPti1基因的表达分析
• 2.6 拟南芥的ZmPti1基因转化及鉴定
• 2.6.1 ZmPti1植物表达载体的构建
• 2.6.2 农杆菌感受态细胞的制备及转化
• 2.6.3 农杆菌介导的基因转化
• 2.6.4 转基因植株鉴定
• 2.7 转ZmPti1基因拟南芥的抗病性鉴定
• 2.7.1 植物材料的准备
• 2.7.2 病原菌的准备
• 2.7.3 接种病原菌
• 2.8 转ZmPti1基因拟南芥的抗盐性鉴定
• 2.8.1 过量表达ZmPti1基因对盐胁迫下拟南芥生长形态、生物量及产量的影响
• 2.8.2 过量表达ZmPti1基因对盐胁迫下拟南芥生理生化指标的影响
• 第三章 结果与讨论
• 1 结果
• 1.1 ZmPti1基因的克隆与序列分析
• 1.1.1 玉米根中总RNA的提取
• 1.1.2 ZmPti1的RT-PCR
• 1.1.3 PCR产物的pGEM-T载体连接及验证
• 1.1.4 ZmPti1蛋白序列的分析
• 1.1.5 ZmPti1蛋白序列与相关序列的比对及进化树分析
• 1.2 ZmPti1蛋白的酵母表达及激酶活性测定
• 1.2.1 ZmPti1蛋白酵母表达载体的构建
• 1.2.2 ZmPti1蛋白在酵母中的表达及激酶活性测定
• 1.3 ZmPti1基因的表达分析
• 1.4 ZmPti1的转基因植株的获得和性状检测
• 1.4.1 植物表达载体的构建
• 1.4.2 拟南芥转化植株的筛选
• 1.4.3 拟南芥转基因植株的分子检测
• 1.4.4 拟南芥转基因植株抗病性鉴定
• 1.4.5 转基因拟南芥植株抗盐性鉴定
• 2 讨论
• 2.1 ZmPti1编码一个有功能的蛋白激酶
• 2.2 ZmPti1的表达受不同逆境条件的调控
• 2.3 ZmPti1提高了转基因植株的抗盐性
• 2.4 ZmPti1在逆境胁迫信号途径中可能的地位
• 3 结论
• 第二部分 玉米盐胁迫诱导基因ZmSPK1的克隆、序列分析及功能验证
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 1 试验材料和试剂
• 2 试验方法
• 第三章 结果与讨论
• 1 结果
• 1.1 ZmSPK1基因的克隆与序列分析
• 1.1.1 玉米根中总RNA的提取
• 1.1.2 ZmSPK1的RT-PCR
• 1.1.3 PCR产物的pGEM-T载体连接及验证
• 1.1.4 ZmSPK1蛋白序列的分析
• 1.1.5 ZmSPK1蛋白序列与相关序列的比对及进化树分析
• 1.2 ZmSPK1蛋白的酵母表达及激酶活性测定
• 1.2.1 ZmSPK1蛋白酵母表达载体的构建
• 1.2.2 ZmSPK1蛋白在酵母中的表达及激酶活性测定
• 1.3 ZmSPK1基因的表达分析
• 1.4 ZmSPK1的转基因植株的获得和性状检测
• 1.4.1 植物表达载体的构建
• 1.4.2 拟南芥转化植株的筛选
• 1.4.3 拟南芥转基因植株的分子检测
• 2 讨论
• 3 结论
• 第三部分 玉米盐胁迫诱导基因ZmASK1的克隆、序列分析及功能验证
• 第一章 前言
• 第二章 材料与方法
• 1 试验材料和试剂
• 2 试验方法
• 第三章 结果与讨论
• 1 结果
• 1.1 ZmASK1基因的克隆与序列分析
• 1.1.1 玉米根中总RNA的提取
• 1.1.2 ZmASK1的RT-PCR
• 1.1.3 PCR产物的pGEM-T载体连接及验证
• 1.1.4 ZmASK1蛋白序列的分析
• 1.1.5 ZmASK1蛋白序列与相关序列的比对及进化树分析
• 1.2 ZmASK1基因的表达分析
• 1.3 ZmASK1的转基因植株的获得和性状检测
• 1.3.1 植物表达载体的构建
• 1.3.2 拟南芥转化植株的筛选
• 1.3.3 拟南芥转基因植株的分子检测
• 2 讨论
• 3 结论
• 全文总结以及研究的创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的学术论文