LTF基因在鼻咽癌中的表达及其与甲基化的关系

论文摘要

鼻咽癌是一种好发于我国南方各省及东南亚一带的上皮源性恶性肿瘤。流行病学及实验研究表明,鼻咽癌的发生是多阶段、多途径、多因素共同参与的复杂过程,遗传易感性、Epstein-Barr病毒（EBV）感染及包括饮食在内的环境因素等对鼻咽癌的发生起重要作用。在这些因素的共同作用下,鼻咽上皮细胞的鼻咽癌相关瘤基因和抑瘤基因发生遗传学变异和表遗传学改变的不断积累,最终引起细胞的恶性转化。乳铁蛋白（lactotransferrin,LTF）是一种分泌性糖蛋白,可表达于多种组织中。一系列体内体外实验证明LTF具有多种生物学功能,它参与铁平衡、免疫调节、抗炎、抗肿瘤、止痛、调节骨代谢,参与胚胎发育和生殖等过程。本实验室前期工作通过分析鼻咽癌基因表达谱的结果选取了位于鼻咽癌高频缺失区3p21.3-22的LTF基因作为研究对象,探讨该基因与鼻咽癌发生发展的关系。实验结果显示,LTF基因在鼻咽癌组织（76%）中和7株鼻咽癌细胞系（100%）表达缺失或下调:原因分析显示其中63.6%、25%和30%的鼻咽癌组织及14%、14%和100%的鼻咽癌细胞系中分别存在启动子区DNA甲基化、微卫星位点LOH和基因突变。野生型LTF基因导入鼻咽癌细胞系5-8F后,稳定表达LTF基因的5-8F细胞细胞周期阻滞于G0-G1期,同时体外增殖能力和克隆形成能力下降。这些研究结果表明LTF基因很可能是一个与鼻咽癌关系密切的候选抑瘤基因。在此基础上,本课题进一步分析了LTF基因的两个转录本LTF和△LTF在鼻咽癌组织中的表达。同时构建LTF基因P1和P2启动子甲基化与未甲基化的报告载体,并导入CNE2,观察启动子甲基化对LTF基因表达的调控作用。此外,野生型LTF基因被导入到鼻咽癌细胞系CNE2中并观察稳定表达LTF基因的CNE2细胞体内外生物学特性的影响,明确LTF基因在CNE2细胞中的作用。这些为探讨研究甲基化修饰与鼻咽癌组织LTF基因表达下调或缺失的相关性及LTF基因与鼻咽癌发生发展关系提供了进一步的证据。实验方法和结果如下:首先,采用RT-PCR方法检测LTF基因两个转录本LTF和△LTF在34例原发性鼻咽癌和17例慢性鼻咽炎的组织表达,结果显示LTF和△LTF基因在慢性鼻咽炎组织中稳定表达,在82.35%（26/34）原发性鼻咽癌中表达缺失或下调。接着实验构建了LTF基因启动子甲基化和未甲基化的报告载体。启动子报告载体瞬时转染入6-10B和CNE2细胞,报告基因检测表明CNE2细胞比6-10B细胞具有相对较高的LTF启动子活性。定位于-99～+16区域启动子报告载体pGL3B/P1-116在6-10B和CNE2细胞中其报告基因都具有相对较高的活性,推测-99～+16区域为核心的启动子区。我们选择CNE2细胞做启动子regional methylation实验。SssI处理和对照的启动子连入报告载体并瞬时转染CNE2细胞,报告基因活性分析提示,与对照组相比,甲基化的LTF基因启动子活性明显降低,推测甲基化修饰抑制LTF启动子功能可能是NPC中LTF表达下调或缺失的重要原因。此外,实验采用Origene公司含LTF基因cDNA序列的克隆载体pCMV6-XL5-LTF,并利用Not I酶切位点定向克隆到pcDNA3.1（-）载体中,构建了LTF基因的真核表达载体（pcsLTF）。利用脂质体将pcsLTF导入CNE2细胞,G418筛选获得抗性克隆,进一步采用RT-PCR检测LTF基因的mRNA表达,采用Western blotting检测LTF蛋白的表达,结果表明成功建立稳定表达LTF基因的CNE2细胞系（CNE2-LTF）。实验进一步检测了CNE2-LTF细胞的生物学特征:流式细胞分析结果表明,与对照组相比转染pcsLTF后可以使CNE2细胞阻滞于G1期,G0-G1期细胞比例明显增加（64.80%vs 55.13%）,G2-M期（7.76%vs 15.13%）细胞比例减少。MTT的结果表明CNE2-LTF细胞的增殖速度明显低于对照组（P＜0.05）;平板克隆形成实验结果显示CNE2-LTF细胞的克隆形成率明显低于对照组（37.5%vs 52.2%）。提示LTF基因稳定表达后导致CNE2细胞的增殖能力和克隆形成能力降低。裸鼠成瘤实验表明CNE2-LTF细胞肿瘤形成能力明显降低（P＜0.05）本课题的实验结果表明,LTF基因两个转录本LTF与△LTF在原发性鼻咽癌表达缺失或下调;启动子区甲基化对LTF基因在鼻咽癌中表达下调或缺失可能起着重要作用;LTF基因稳定表达于CNE2细胞可明显改善其恶性生物学特性,使细胞阻滞于G1期,增殖能力和克隆形成能力降低,且裸鼠成瘤能力降低。综上所述,我们推测LTF基因很可能是鼻咽癌的候选抑瘤基因之一,LTF在鼻咽癌的发生发展中发挥重要作用,其具体作用还需要更多的体内外实验进行证实。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文注解
• 前言
• 技术路线图
• 第一章 鼻咽癌LTF基因表达检测及启动子甲基化研究
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 实验结果
• 1.2.1 检测LTF基因两个转录本在慢性鼻咽炎和鼻咽癌组织中的表达
• 1.2.2 启动子报告载体的构建
• 1.2.3 甲基化的启动子报告载体的构建
• 1.2.4 细胞内检测甲基化修饰对启动子活性的影响
• 1.3 讨论
• 1.3.1 LTF在肿瘤中功能失活的机制
• 1.3.2 LTF启动子序列的SNP
• 1.3.3 启动子报告载体
• 1.3.4 LTF基因转录因子
• 1.3.5 甲基化对LTF启动子活性的影响
• 第二章 鼻咽癌候选抑瘤基因LTF生物学功能的初步研究
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 实验结果
• 2.2.1.真核表达载体构建
• 2.2.2 建立稳定转染pcsLTF的CNE2鼻咽癌细胞系
• 2.2.3 RT-PCR分析稳定转染CNE2-LTF细胞中LTF基因在mRNA表达
• 2.2.4 PCR鉴定稳定转染CNE2-pc3.1细胞中pcDNA3.1（-）的整合
• 2.2.5 Western blotting检测稳定转染后LTF基因在蛋白质表达
• 2.2.6 稳定转染LTF基因对CNE2细胞生物学特性的影响
• 2.3.讨论
• 2.3.1 稳定转染的CNE2-LTF细胞中的LTF蛋白
• 2.3.2 LTF抑制CNE2细胞生长
• 2.3.3 后续实验
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间主要的研究成果目录