基于EST的超高产橡胶树胶乳基因表达谱分析及其高产机理探讨以及坛紫菜丝状孢子体基因表达分析

论文摘要

基因表达序列标签（Expressed Sequence Tag,EST）是指对cDNA克隆进行末端测序所得的长度为100-500bp可以用来代表基因的序列片段。自1991年技术被首次提出以来,因其能低廉、快速、高通量获得基因表达信息,而得到迅速发展。EST已成为公共数据库中增长最快的数据,EST技术亦被广泛应用到分子遗传学、基因组学等生命科学的多个研究领域。除用于研究基因表达外,EST还被应用于新基因发现、基因图谱构建、单核苷酸多态性（SNP）研究、基因芯片技术、选择性剪切识别以及系统进化分析等众多方面。本论文详细介绍了基于EST测序的超高产橡胶乳管和坛紫菜丝状孢子体基因表达分析。天然橡胶是重要的工业原料和战略储备物资,在云南橡胶种植园发现的超高产橡胶树为研究橡胶高产机理,筛选高产相关基因提供了宝贵的材料。本研究中随机挑取了22688个胶乳基因cDNA克隆进行5’端测序,获得20126个高质量的EST,聚类拼接后得到6606条暂定一致性序列（TC:Tentative ConsensusSequences）,包括3120个congtig和2986个singlet。通过BLAST注释,5263条序列能找到高度同源序列,注释率为79.7%,剩下1343条为未知序列。注释结果显示超高丰度和高丰度表达基因主要编码与橡胶生物合成和防御相关的蛋白,如REF（2290 ESTs）,Hevein（919 ESTs）,SRPP（525 ESTs）,HSP（151 ESTs）等。对已注释的功能基因进行分类,显示参与细胞代谢、次生代谢和大分子代谢功能的基因普遍高表达,与生物合成和对刺激反应等功能相关的基因表达丰度较高。通过代谢途径分析,我们找到了编码橡胶生物合成过程中的13个主要蛋白,除超高表达的REF和SRPP外,还包括MVA通路上的所有关键酶基因和催化大分子合成的酶基因,由此推测MVA途径为超高产橡胶胶乳中主要的橡胶合成途径。比较分析发现在超高产胶和普通胶之间有65个基因存在显著差异表达（P＜0.05）,其中11个为高表达,54个为低表达。高表达基因主要与生物合成、刺激反应、防御反应及大分子定位等功能相关。与橡胶合成密切相关的13个蛋白中橡胶延伸因子（REF）、小橡胶粒子蛋白（SRPP）、甲羟戊酸激酶（MK）、磷酸甲羟戊酸激酶（PMK）和异戊烯基焦磷酸异构酶（IPPI）在超高产胶中表达量较高,推测它们与橡胶高产相关。紫菜兼具重要的经济价值和理论研究价值,有着典型的世代交替生活史,已逐渐成为海洋藻类研究的模式生物。坛紫菜是我国特有的栽培品种,本研究是首次对坛紫菜进行大规模的EST测序和分析以及数据库构建,初步探讨了坛紫菜孢子体世代基因表达特征和世代间差异表达基因。随机测序11000个克隆,经过聚类拼接得到2182条TCs,其中Singlet 1310条,Contig872条。经同源搜索发现,690条TC序列能在NCBI数据库中找到其高度同源序列,注释率为32%。功能分析发现孢子体世代功能基因主要集中于细胞过程和代谢过程,其中又以绑定和催化活性功能相关基因比例最高（818 ESTs,占总有效测序量15.3%）,其次为大分子复合物、细胞器组成、核酸绑定、水解酶活性、氧化还原等功能。代谢途径分析表明,除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）以外,PCK型C4固碳途径中的关键酶均被发现,特别是磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶（PEPCK）基因高峰度表达,推测坛紫菜丝状体世代很可能存在高效率的C4固碳途径。尽管坛紫菜与条斑紫菜在形态上非常相似,但在基因组成上却仅有不到30%的相似性,4种热休克蛋白在坛紫菜孢子体特异性表达,44个基因在孢子体中可能表达上调。密码子使用分析显示坛紫菜在进化中受到高GC压力的影响。3680条EST已递交到dbEST数据库（DN604790—DN608469）。这是首次对坛紫菜进行大规模EST测序,所得数据和结论对今后紫菜分子生物学和世代交替分子机制的研究提供了重要的资源。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 目录
• 图目录
• 表目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 EST简介
• 1.2 EST技术原理
• 1.3 EST技术应用
• 1.4 其它高通量技术
• 1.5 EST数据库
• 1.6 天然橡胶分子生物学研究
• 1.6.1 天然橡胶生产现状
• 1.6.2 乳管的分子生物学研究
• 1.6.3 激素对橡胶生物合成调控的研究
• 1.6.4 DNA分子标记在橡胶树的应用
• 1.6.5 天然橡胶研究方向
• 第二章 超高产橡胶树胶乳基因表达谱分析及橡胶高产机理的初步研究
• 2.1 摘要
• 2.2 引言
• 2.3 材料和方法
• 2.3.1 材料
• 2.3.2 仪器及试剂
• 2.3.3 方法
• 2.4 结果
• 2.4.1 mRNA制备及cDNA合成
• 2.4.2 测序和拼接
• 2.4.3 注释结果和分析
• 2.4.4 功能分类和代谢途径分析
• 2.4.5 超高产橡胶树和普通橡胶树胶乳中差异表达基因的确定
• 2.5 结论与讨论
• 2.5.1 序列获取和表达谱分析
• 2.5.2 超高产橡胶树胶乳中高丰度表达的基因
• 2.5.3 与普通橡胶树胶乳差异表达的基因
• 2.5.4 橡胶合成途径及相关蛋白分析
• 2.5.5 小结
• 2.6 后续工作和展望
• 第三章 坛紫菜丝状孢子体表达谱构建与生物信息学分析
• 3.1 摘要
• 3.2 引言
• 3.2.1 紫菜的研究意义
• 3.2.2 紫菜的研究现状
• 3.3 材料和方法
• 3.3.1 材料
• 3.3.2 方法
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 EST数据整体概况
• 3.4.2 TC序列注释
• 3.4.3 功能基因注释及分类
• 3.4.4 孢子体中代谢途径分析
• 3.4.5 基因组比较分析
• 3.4.6 密码子使用分析
• 3.5 讨论与结论
• 3.5.1 EST测序和注释
• 3.5.2 紫菜的光合固碳
• 3.5.3 紫菜的抗氰呼吸
• 3.5.4 紫菜的糖代谢
• 3.5.5 坛紫菜和条斑紫菜
• 3.6 后续工作建议
• 参考文献
• 附表一:基于GO的超高产橡胶胶乳表达基因功能分类
• 作者简历及发表论文