多聚半乳糖醛酸酶（PGs）基因在青香蕉苹果果实中的表达分析及反义真核表达载体的构建

论文摘要

果实硬度是关系到口感和果实保鲜期的一个重要指标,与果实抵抗机械损伤、裂果、真菌侵染密切相关。果实软化是果胶物质降解和细胞分离的结果,多聚半乳糖醛酸酶（PGs）与果实软化密切相关。该酶是一种细胞壁蛋白,在细胞壁结构的改变中起重要作用,催化果胶分子中α- （1、4）-多聚半乳糖醛酸的裂解,从而参与果胶的降解,促进果实软化。1-MCP是近几年来新发现的乙烯作用抑制剂,它能够竞争结合乙烯受体蛋白,阻碍该受体与乙烯的结合,从而具有抑制或延缓植物生理老化的作用,已经在切花保鲜中广泛应用,近来也应用到了果品保鲜中。本研究运用改良的CTAB方法提取RNA,经过RT-PCR克隆得到PG基因,以1-MCP为乙烯抑制剂,使用Northern杂交法分析冷藏苹果果实硬度变化、乙烯释放、呼吸强度与PG基因表达之间的联系,并构建反义表达载体转化烟草。主要结果如下:1.采用改良的CTAB-LiCl法从苹果果皮中提取到高质量的RNA。2.利用RT-PCR方法,从苹果果皮中克隆到PG酶基因。3.使用Northern杂交法研究了PG基因表达、乙烯、呼吸强度与果实硬度之间的关系。结果表明:在当使用1-MCP抑制乙烯释放时,PG基因的表达完全被抑制,而对照果实随着储藏时间的延长,PG表达量不断增加;1-MCP（0.5μmol/L）对果实乙烯的释放起到了良好的抑制作用,而对照组果实随储藏时间的延长,乙烯释放不断增强;1-MCP明显降低了果实的软化过程,13天内硬度仅下降了8.7%,明显低于对照组的51%;1-MCP对呼吸强度也有明显的抑制作用。实验证实,PG是青香蕉苹果果实硬度的一个调控酶,受乙烯的诱导,随着硬度的下降,它的表达量不断增加。4.构建了pBI-PG反义表达载体,并转化烟草,得到了转PG基因烟草,为进一步研究该基因功能和转化苹果打下基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 多聚半乳糖醛酸酶
• 1.1.1 多聚半乳糖醛酸酶在果实软化中的作用
• 1.1.2 PG 基因功能的多样性
• 1.1.2.1 PG 与器官的脱落和种子发育
• 1.1.2.2 PG 与花粉授粉
• 1.1.2.3 PG 与病害发生
• 1.1.2.4 PG 基因启动子功能研究
• 1.1.2.5 其它功能
• 1.1.3 PG 基因及表达调控
• 1.1.4 植物激素对多聚半乳糖醛酸酶的影响
• 1.1.4.1 乙烯对多聚半乳糖醛酸酶的影响
• 1.1.4.2 ABA 对多聚半乳糖醛酸酶的影响
• 1.1.4.3 多胺对多聚半乳糖醛酸酶的影响
• 1.1.4.4 其他激素对多聚半乳糖醛酸酶的影响
• 1.2 1-MCP 作用机理及生理效应
• 1.2.1 1-MCP 的作用机理
• 1.2.2 1-MCP 的生理效应
• 1.2.2.1 对乙烯释放和呼吸作用的影响
• 1.2.2.2 对色泽、风味及硬度的影响
• 1.2.2.3 对可滴定酸、氨基酸、可溶性固形物等的影响
• 1.2.2.4 对生理病害的影响
• 1.2.2.5 对酶活性的影响
• 1.3 本研究的目的意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 植物材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 酶及生化试剂
• 2.1.3 PCR 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 材料处理
• 2.2.2 乙烯释放速率的测定
• 2.2.3 果实硬度的测量
• 2.2.4 呼吸速率的测定
• 2.2.5 RNA的提取方法
• 2.2.6 RNA 反转录
• 2.2.7 苹果PG酶基因的分离
• 2.2.7.1 PCR扩增PG酶的cDNA
• 2.2.7.2 PCR产物的回收纯化
• 2.2.7.3 连接反应
• 2.2.7.4 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.2.7.5 转化及克隆筛选
• 2.2.7.6 碱法小量提取质粒 DNA
• 2.2.7 Northern杂交
• 2.2.7.1 配制药品
• 2.2.7.2 甲醛变性胶电泳
• 2.2.7.3 转膜
• 2.2.7.4 预杂交
• 2.2.7.5 探针的制备
• 2.2.8 植物反义表达载体的构建及烟草转化
• 2.2.8.1 PG酶基因片段扩增
• 2.2.8.2 连接反应及转化
• 2.2.8.3 碱法大量提取质粒DNA
• 2.2.8.4 筛选和鉴定
• 2.2.8.5 转化，酶切，回收
• 2.2.8.6 目的片段插入到改造过的PBI121质粒载体
• 2.2.8.7 根癌农杆菌LBA4404感受态细胞的制备及转化
• 2.2.8.8 转基因烟草的 PCR 检测
• 3 结果与分析
• 3.1 1-MCP 处理对青香蕉苹果乙烯释放速率的影响
• 3.2 1-MCP 处理对苹果果实硬度的影响
• 3.3 1-MCP 处理对苹果果实呼吸强度的影响
• 3.4 苹果果皮 RNA 的提取及反转录
• 3.5 PG 基因的克隆
• 3.6 PG 基因反义表达载体的构建及烟草转化研究
• 3.6.1 PBI 质粒载体的酶切
• 3.6.2 目的片段的 PCR 扩增
• 3.6.3 重组质粒的 PCR 和酶切鉴定
• 3.6.4 表达载体pBI-PG 的 PCR 及酶切鉴定
• 3.6.5 转基因烟草的 PCR 检测
• 3.7 northern 分析
• 4 讨论
• 4.1 RNA 提取方法的改进
• 4.2 苹果果实硬度变化、乙烯释放、呼吸强度与 PG基因表达之 间的联系
• 4.3 反义表达载体的构建和烟草转化
• 4.4 进一步研究的设想
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间完成的论文