人IL-12联合HSV-tk基因体外靶向特异性杀伤肝癌细胞的研究

论文摘要

本研究从肝癌基因治疗存在的有效性与安全性问题出发,采用HSV-tk与IL-12双基因联合的方法以提高肝癌基因治疗的有效性,而利用肝癌的特异性启动子启动联合基因在肝癌细胞内特异性表达,增强肝癌基因治疗的安全性。为此本研究利用基因重组技术构建联合基因靶向特异性治疗肝癌的载体,并在体外细胞水平验证该载体杀伤肝癌细胞的有效性与特异性。本论文取得了如下学术进展:1应用PCR技术成功从人外周血基因组中调取人甲胎蛋白基因启动子（pAFP）、增强子（eAFP）。并将克隆的pAFP与增强子eAFP先后连接入真核表达载体,构建成由pAFP与eAFP启动基因表达的载体。利用报告基因β-半乳糖甘酶基因（β-gal）验证了该启动子具有启动基因在肝癌细胞中表达的特异性。2成功应用连接肽将人IL-12基因的两个亚单位基因拼接为单链基因。应用核糖体进位位点（IRES）将IL-12基因与单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（HSV-tk）拼接在一起,构建成HSV-tk与IL-12融合的真核基因表达载体。通过体外实验研究结果表明,两个基因可以在肝癌细胞内同时表达,并具有相应的抗肿瘤与激活免疫细胞的功能。说明这两个基因在统一启动子控制下可实现共同表达,使免疫增强基因IL-12与肿瘤自杀基因HSV-tk同步共表达,增强两条途径杀伤肿瘤的协同作用。3成功构建了由人甲胎蛋白基因启动子（pAFP）、增强子（eAFP）控制下的IL-12与HSV-tk联合基因表达载体,将该载体体外转染肝癌细胞以及非肝癌细胞,实验结果表明IL-12与HSV-tk基因在肝癌细胞内有特异性的表达,表达HSV-tk基因的肝癌细胞对GCV有敏感性,并可产生杀伤肿瘤的旁观者效应。IL-12可以促进体外淋巴细胞的增殖,以及IFN-γ的分泌。这些研究结果说明克隆的人甲胎蛋白基因启动子（pAFP）、增强子（eAFP）可特异性启动IL-12与HSV-tk在分泌AFP肝癌细胞内特异性表达,并具有杀伤肝癌细胞功能。本研究在一个载体上实现了联合基因的共同表达以及基因表达的肝癌靶向性,为进一步利用该载体进行肝癌的基因治疗奠定了理论与实验基础。

论文目录

• 提要
• 英文缩写词表
• 第1篇 综述
• 第1章 甲胎蛋白启动子调控治疗基因靶向肝癌细胞表达的研究进展
• 1.1 AFP 基因上游调控元件
• 1.2 AFP 启动子调控基因靶向特异性治疗肝癌的研究
• 1.3 提高AFP 调控基因表达的效率
• 第2章 IL-12 治疗肿瘤的临床应用研究进展
• 2.1 IL-12 重组蛋白的临床应用
• 2.2 IL-12 基因治疗的临床应用
• 2.3 结束语
• 第3章 HSV-tk/GCV 系统治疗肿瘤的临床研究进展
• 3.1 HSV-tk/GCV 系统的临床应用研究
• 3.2 HSV-tk/GCV 系统联合基因治疗
• 第2篇 实验研究
• 前言
• 第1章 AFP 启动子和增强子的克隆以及表达载体的建立
• 1.1 主要材料与仪器
• 1.2 实验方法
• 1.3 实验结果
• 1.4 讨论
• 第2章 IL-12 联合HSV-tk 基因特异性外杀伤肝癌细胞的研究
• 2.1 材料与仪器
• 2.2 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 博士期间发表的论文以及参与课题
• 致谢
• 中文摘要
• Abstract