用于胰岛素口服给药和肿瘤靶向的壳聚糖衍生物接枝纳米粒

论文摘要

为研究生物大分子药物口服给药系统,分别制备了壳聚糖盐酸盐接枝纳米粒（CHNPs）、壳聚糖季铵盐接枝纳米粒（TMCNPs）、羧化壳聚糖接枝纳米粒（CCNPs）和羧甲基壳聚糖接枝纳米粒（CMCNPs）,考察其理化性质。以胰岛素为模型药物,研究纳米粒的载药特性、体外释药规律、体内作用及吸收机理。以香豆素（6-coumarin）标记的CCNPs为载体,研究其在肿瘤靶向中的应用。1壳聚糖衍生物接枝纳米粒的制备和表征分别以壳聚糖盐酸盐（CH）、壳聚糖季铵盐（TMC）、羧化壳聚糖（CC）和羧甲基壳聚糖（CMC）为亲水大分子单体,甲基丙烯酸甲酯（MMA）为疏水单体,经接枝共聚形成两亲性大分子,水溶液中自组装形成核壳型的CHNPs、TMCNPs、CCNPs和CMCNPs。考察纳米粒的结构、粒径、Zeta电势、形态和稳定性等。结果表明,制得的纳米粒粒径为100～300nm,粒径分布均匀;CHNPs和TMCNPs的Zeta电势为正值,CCNPs和CMCNPs的Zeta电势为负值;CCNPs在胃液中聚集,肠液中分散成纳米粒;CCNPs和CMCNPs冻干和室温贮存稳定性良好。2载胰岛素纳米粒研究考察载胰岛素纳米粒的形态、粒径、Zeta电势、包封率、载药量及体外释放性质。采用内源荧光光谱、外源荧光光谱、圆二色谱和双荧光标记法研究胰岛素在纳米粒中的载药方式。结果表明,TMCNPs和CCNPs的包封率大于80%,载药量高于10%;CHNPs和CMCNPs的包封率和载药量较低;载胰岛素前后CCNPs的粒径和形态未发生明显变化;Zeta电势随胰岛素浓度增加其绝对值减小;胰岛素可通过氢键、静电作用及范德华力包载至纳米粒;载胰岛素纳米粒的体外释放具pH敏感性。研究胰岛素-CCNPs在正常大鼠、糖尿病大鼠及Beagle犬体内的口服降血糖效果。与胰岛素溶液相比,正常大鼠皮下注射胰岛素-CCNPs后血糖最低下降至初始值的41%。正常大鼠口服胰岛素溶液及不同剂量胰岛素-CCNPs,100u·kg-1时,2～12h内血糖降为初始值的80%～67%;15u·kg-1时,降血糖效果不明显;对照组胰岛素溶液无降血糖效果;胰岛素-CCNPs(25u·kg-1)的口服药理生物利用度为9.7%。糖尿病大鼠口服胰岛素-CCNPs,6～16h内血糖浓度降低为初始值的80%以下,16h达到最低值,为初始值的35%。Beagle犬口服胰岛素-CCNPs(16.5u·kg-1),4h内血糖降低为初始值的60～80%。考察CCNPs体外抑酶作用和对肠道紧密连接的影响,并研究香豆素标记的CCNPs在Peyer’s结处的吸收。结果表明,CCNPs可使胰蛋白酶活力下降75%,胃蛋白酶活力下降80%;CCNPs可打开肠道紧密连接,并在肠道Peyer’s结处被吸收。选择FITC-胰岛素和藻蓝蛋白包载至纳米粒,进一步研究胰岛素口服吸收机理。测定FITC-胰岛素与胰蛋白酶作用后的荧光光谱;考察SD大鼠口服FITC-胰岛素和载FITC-胰岛素的CCNPs后的体内分布;分别测定藻蓝蛋白与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用后的紫外光谱和荧光光谱。结果表明,FITC-胰岛素与胰蛋白酶作用后,荧光强度增强;大鼠口服FITC-胰岛素和载FITC-胰岛素的CCNPs6h后,肝、脾中荧光均较强;藻蓝蛋白与胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶作用后,紫外吸收和荧光强度均减小,蛋白浓度与紫外吸收及荧光强度呈正相关。3载黏膜黏附性纳米粒双层膜口服给药载体以Na2-EDTA为交联剂制备壳聚糖水凝胶,加入CCNPs冻干粉,以乙基纤维素膜为背衬层制备载纳米粒壳聚糖水凝胶双层膜(NP-FilmCH)。对壳聚糖水凝胶膜的形态、粘度、流变行为和体外黏附力等进行表征,并考察CCNPs在不同介质中的体外释放特性。壳聚糖水凝胶具有典型的网络结构,纳米粒可分散其中。壳聚糖水凝胶膜的黏膜黏附力为壳聚糖盐酸盐膜的2～8倍,在回肠处的黏膜黏附力较大。pH 1.2释放介质中,纳米粒从水凝胶膜中释放较慢;pH 7.4 PBS释放介质中,纳米粒释放较快。将CCNPs冻干粉载入海藻酸钠水凝胶中并以疏水性乙基纤维素膜为背衬层制备双层膜(NP-FilmSA)。荧光显微镜和扫描电镜观察纳米粒在双层膜中形态,考察水凝胶的溶胀性、黏膜黏附性和纳米粒释放特性,以钙黄绿素作为荧光模型多肽,观察载药纳米粒在水凝胶膜中的形态。离子强度较低时,海藻酸钠水凝胶膜溶胀率较高;离子强度较高时,其溶胀率较低;pH 5.8和pH 8.0时,其溶胀率较高,pH 1.7时,其溶胀率较低。海藻酸钠水凝胶膜的体外黏膜黏附力达6000N·m-2。0.01 mol·l-1HCl中,CCNPs释放较慢,2h累计释放量约为10%;pH 6.5和pH 7.4 PBS中,CCNPs快速释放。海藻酸钠水凝胶膜含较多孔隙,大小均一的纳米粒可均匀分散在孔隙中。4香豆素标记CCNPs在肿瘤细胞中的分布以亲脂性荧光染料香豆素标记CCNPs,比较香豆素标记CCNPs在H1299肺癌和HEK293胚肾细胞中的分布情况,研究其组织分布、活体光学成像及体外巨噬细胞摄取。结果表明,香豆素标记CCNPs可被H1299细胞摄取,而不被HEK293胚肾细胞摄取。纳米粒定向聚集于肿瘤部位,肺、肝、肾和脾脏的摄取较少,具有一定的靶向性。5生物相容性研究以溶血试验、动态凝血时间测定、血小板黏附和形态学观察等方法研究纳米粒的血液相容性,小肠生化损伤、肌肉植入和组织损伤等试验研究材料的组织相容性。CCNPs、CMCNPs和TMCNPs溶血率均低于5%,符合生物材料溶血率要求。与硅化玻璃相比,CCNPs的动态凝血时间较长;CCNPs和CMCNPs的血浆复钙时间延长达40%。CHNPs、CCNPs、CHNPs和壳聚糖水凝胶膜与血小板作用后,血小板未发生变形。CCNPs和NP-FilmCH的乳酸脱氢酶（LDH）泄漏值与PBS测定结果相近,表明材料对肠细胞没有生化损伤。壳聚糖水凝胶、CCNPs和CMCNPs对肌肉组织没有损伤。

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摘要

Abstract

前言

1 壳聚糖纳米粒

2 胰岛素口服给药

3 黏膜黏附材料在蛋白质多肽类药物口服给药中的应用

4 纳米粒在肿瘤早期诊断中的应用

5 光学成像在肿瘤诊断中的应用

6 课题设计思路

参考文献

第一部分壳聚糖衍生物接枝纳米粒的合成与表征

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 壳聚糖衍生物粘均分子量测定

2.2 壳聚糖季铵盐的合成

2.3 壳聚糖及其衍生物接枝纳米粒的合成

2.4 纳米粒的溶解性

2.5 FITC标记纳米粒的制备

2.6 香豆素标记CCNPs的制备

2.7 纳米粒光谱表征

2.8 纳米粒形态观察

2.9 纳米粒粒径与Zeta电势测定

2.10 纳米粒表面固有水化层厚度测定

2.11 纳米粒表面张力测定

2.12 纳米粒临界聚沉浓度测定

2.13 纳米粒的稳定性

3 结果与讨论

3.1 材料选择

3.2 壳聚糖衍生物粘均分子量测定

3.3 壳聚糖及其衍生物接枝共聚反应机理

3.4 纳米粒溶解性

3.5 纳米粒光谱表征

3.6 纳米粒形成机理

3.7 纳米粒形态

3.8 纳米粒粒径分布

3.9 纳米粒Zeta电势

3.10 纳米粒粒径和Zeta电势的影响因素

3.11 纳米粒固有水化层厚度

3.12 纳米粒表面张力

3.13 纳米粒临界聚沉浓度

3.14 纳米粒稳定性

4 小结

参考文献

第二部分载胰岛素纳米粒研究

第一章载胰岛素纳米粒的制备与表征

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 圆二色谱研究胰岛素的结构和稳定性

2.2 胰岛素含量测定

2.3 载胰岛素纳米粒制备

2.4 载药量和包封率测定

2.5 胰岛素-CCNPs表征

2.6 载胰岛素纳米粒的结构

2.7 藻蓝蛋白的提取与表征

2.8 荧光双标记纳米粒的制备

2.9 载胰岛素纳米粒体外释放

3 结果与讨论

3.1 胰岛素结构和稳定性

3.2 胰岛素标准曲线及其线性范围

3.3 纳米粒载药能力

3.4 胰岛素-CCNPs透射电镜观察

3.5 载胰岛素纳米粒粒径与表面电势

3.6 载胰岛素纳米粒结构

3.7 藻蓝蛋白的提取与表征

3.8 双荧光标记纳米粒

3.9 载胰岛素纳米粒的体外释放

4 小结

第二章载胰岛素纳米粒口服给药降血糖作用

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 血糖值测定

2.2 降血糖试验

3 结果与讨论

3.1 正常大鼠皮下注射胰岛素和胰岛素-CCNPs

3.2 正常大鼠口服胰岛素-CCNPs

3.3 糖尿病大鼠口服给予胰岛素-CCNPs

3.4 Beagle犬口服胰岛素-CCNPs

3.5 Beagle犬口服胰岛素-CCNPs胶囊

4 小结

第三章载胰岛素纳米粒口服吸收机理

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 CCNPs体外抑酶

2.2 CCNPs对肠紧密连接的影响

2.3 香豆素标记CCNPs在Peyer's结处的吸收和分布

3 结果与讨论

3.1 CCNPs对胰蛋白酶和胃蛋白酶活力的影响

3.2 CCNPs对肠紧密连接的影响

3.3 香豆素标记CCNPs在Peycr's结处的吸收和分布

4 小结

第四章荧光模型蛋白的选择

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 FITC-胰岛素与胰蛋白酶作用后的发射和激发光谱

2.2 FITC-胰岛素和FITC-胰岛素-CCNPs口服后肝、脾分布

2.3 藻蓝蛋白与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶作用后紫外和荧光光谱

3 结果与讨论

3.1 FITC-胰岛素与胰蛋白酶作用后的发射和激发光谱

3.2 FITC-胰岛素和FITC-胰岛素-CCNPs口服后肝、脾分布

3.3 藻蓝蛋白与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶作用后的紫外和荧光光谱

4 小结

参考文献

第三部分载黏膜黏附性纳米粒双层膜口服给药载体

第一章纳米粒壳聚糖水凝胶双层膜的制备与表征

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 壳聚糖水凝胶膜的制备

2.2 乙基纤维素膜的制备

2.3 双层膜的制备

CH的制备'>2.4 NP-Film^CH的制备

2.5 扫描电镜观察

2.6 FT-IR

2.7 粘度测定

2.8 流变性质表征

2.9 体外黏附力测定

2.10 钙离子吸附试验

2.11 纳米粒释放

2.12 正常大鼠口服给予载胰岛素纳米粒双层膜

3 结果与讨论

3.1 双层膜模式图

3.2 双层膜扫描电镜

3.3 FT-IR

3.4 壳聚糖水凝胶形成机理

3.5 流变性质

3.6 纳米粒双层膜的形态

3.7 体外黏附力

3.8 钙离子吸附

3.9 纳米粒释放

3.10 正常大鼠口服给予载胰岛素纳米粒双层膜

4 小结

第二章纳米粒海藻酸钠水凝胶双层膜的制备与表征

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 乙基纤维素膜的制备

2.2 海藻酸钠水凝胶膜的制备

SA的制备'>2.3 NP-Film^SA的制备

2.4 水凝胶溶胀率测定

2.5 体外黏附力测定

SA扫描电镜观察'>2.6 NP-Film^SA扫描电镜观察

2.7 纳米粒释放

2.8 钙黄绿素纳米粒海藻酸钠水凝胶在不同介质中的形态

3 结果与讨论

3.1 海藻酸钠水凝胶的制备原理

3.2 海藻酸钠水凝胶膜的溶胀

SA的形态'>3.3 NP-Film^SA的形态

3.4 体外黏附力

3.5 纳米粒释放

3.6 钙黄绿素纳米粒海藻酸钠水凝胶在不同介质中的形态

4 小结

参考文献

第四部分香豆素标记CCNPs在肿瘤中的靶向分布

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 载香豆素纳米粒的制备和表征

2.2 荧光纳米粒细胞摄取

2.3 S-180肿瘤模型的建立

2.4 荧光标记纳米粒在荷瘤小鼠中的组织分布

2.5 小鼠活体成像

2.6 小鼠巨噬细胞吞噬试验

3 结果与讨论

3.1 香豆素荧光标记纳米粒

3.2 荧光纳米粒细胞摄取

3.3 香豆素标记CCNPs的组织分布

3.4 小鼠活体成像

3.5 体外巨噬细胞吞噬

4 小结

参考文献

第五部分生物相容性研究

1 材料和仪器

2 实验方法

2.1 溶血试验

2.2 动态凝血

2.3 血浆复钙时间

2.4 血小板黏附

2.5 小肠细胞生化损伤

2.6 肌肉植入

CH组织毒性'>2.7NP-Film^CH组织毒性

3 结果与讨论

3.1 溶血试验

3.2 动态凝血

3.3 血浆复钙时间

3.4 血小板黏附

3.5 小肠细胞生化损伤

3.6 肌肉植入

CH组织毒性'>3.7 NP-Film^CH组织毒性

4 小结

参考文献

总结和展望

致谢

个人简历

文献综述

纳米粒在蛋白质多肽类药物口服给药系统中的应用

纳米粒在肿瘤诊断和治疗中的应用

用于胰岛素口服给药和肿瘤靶向的壳聚糖衍生物接枝纳米粒

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