论文摘要
研究背景霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma,HL）是一种淋巴造血系统的恶性肿瘤,主要分为结节性淋巴细胞为主型（nodular lymphocyte-predominant,NLPHL）和经典型霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin lymphoma,CHL）,其中以CHL最为常见。该病典型形态特点是少数的肿瘤性-H/RS（Hodgkin/Reed-sternberg）细胞分布在大量炎性反应背景细胞中。H/RS细胞的来源及分化机制等问题是目前学术界关注的重点。目前越来越多的证据表明肿瘤的发生是由于正常细胞分化紊乱或分化阻滞的结果。Kuppers等发现绝大部分的H/RS细胞具有B细胞表型丢失和发育不全的早期浆细胞分化潜能等B细胞分化紊乱的特点,为此,本研究的重点在于寻找能够逆转HR/S细胞分化紊乱的关键靶点。逆转HR/S细胞分化紊乱需要打开向浆细胞分化的开关蛋白PRDM1,从而诱导H/RS细胞向末端B细胞方向再分化。新近文献报道提出miR-9可以负性调控CHL细胞株H/RS细胞内L428细胞中PRDM1的表达,故本课题组以miR-9作为逆转L428细胞分化紊乱的关键靶点开展了系列研究,发现瞬时沉默L428细胞miR-9的表达后,PRDM1的表达明显增加,证实了miR-9能够打开向浆细胞分化的调节关卡蛋白PRDM1进而逆转L428细胞分化阻滞。因此本研究重点为探究miR-9调控L428细胞PRDM1表达的靶基因,以及该靶基因在调控PRDM1表达中所扮演的角色及其涉及的信号通路。令人兴奋的是,已有文献报道了TGF-β1/Smads通路参与肿瘤分化的调节,以TGF-β受体促进肿瘤细胞分化研究的报道较多,本课题前期相关预实验并验证了TGF-β1/Smads通路在L428细胞分化中起一定的作用,而TGF-βR1在7株B淋巴瘤细胞株中的表达模式与miR-9刚好相反,那么在L428细胞中,TGF-βR1是否为我们寻找的miR-9的靶向调控基因, TGF-β1/Smads通路在L428细胞中所起的作用机制具体是怎样?尚待进一步探究。研究目的1.观测及验证miR-9对L428细胞PRDM1的表达、再分化及生物学行为的影响。2.预测及鉴定miR-9诱导L428细胞PRDM1表达的靶向调控基因。3.探究miR-9调控L428细胞PRDM1表达涉及的TGF-β1/Smads信号通路及TGF-β1/Smads各成员所起的的作用。研究方法1.miR-9对L428细胞PRDM1的表达、再分化及生物学行为的影响（1）设计并构建miR-9慢病毒沉默载体,进行病毒包装,感染至L428细胞中,经流式分选构建稳定表达的细胞株,利用阳离子脂质体法,将miR-9-mimics瞬时转染至稳定沉默miR-9表达的细胞株中即恢复其miR-9的表达；通过Western blot和免疫荧光共聚焦检测检测miR-9化前后PRDM1蛋白的表达变化。（2）荧光显微镜观察miR-9变化前后对L428细胞细胞粘附成团特性变化；利用鬼笔环肽染色检测miR-9变化前后对细胞骨架蛋白F-actin的影响；Western blot检测miR-9变化前后对细胞凋亡相关蛋白Casp-9和Cleaved-Casp-3的影响。（3）利用流式细胞检测miR-9稳定沉默表达后,CHL诊断标记CD15、CD45,B细胞分化相关抗原CD10,以及浆细胞标记CD38和CD138等分化相关抗原表达的变化。2.miR-9的作用靶点的预测及鉴定（1）以miR-9为检索词,利用数据库MiRanda、TargetScan、Pictar及DIANA-microT对miR-9的靶基因进行预测,挑选软件交集较多及预测值较高的靶点;据软件预测及前期实验选择相应的预测靶点,利用荧光定量qRT-PCR检测其在7种B淋巴瘤细胞株中的表达,初步筛选最适靶点。（2）设计构建GV306-TGF-PR1-3’UTR表达载体以及GV306-mutTGF-βR1-3’UTR的突变载体,通过双萤光素酶报告系统检测miR-9是否能够与GV306-TGF-βR1-3’UTR区相结合。（3）利用荧光定量PCR检测miR-9和TGF-βR1在7种B淋巴瘤细胞株中的表达,并且进行性关性分析；Western blot检测miR-9变化前后对TGF-βR1表达的变化。3. TGF-β1/Smads信号通路及其各相关成员在miR-9调控L428细胞PRDM1表达中的作用（1）通过重组人TGF-β1刺激因子激活L428细胞的TGF-β1/Smads信号通路和TGF-β1受体阻断剂SB431542阻断稳定沉默miR-9表达的细胞株L428-miR-9-inhibitor细胞中TGF-β1/Smads信号通路,Western blot检测TGF-β1/Smads信号通路激活和阻断前后浆细胞分化开关蛋白PRDM1的表达；并用流式细胞检测L428细胞TGF-β1/Smads信号通路激活后L428细胞分化相关抗原表达的变化。（2）利用Western blot分别检测稳定沉默L428细胞miR-9的表达和重组人TGF-β1刺激因子激活L428细胞TGF-β1/Smads信号通路后Smad2、Smad3、 P-Smad2、P-Smad3、Smad4的表达变化；同时利用Western blot检测siRNA瞬时干扰稳定沉默miR-9表达细胞株L428-miR-9-inhibitor细胞中的Smad2、 Smad3、TGF-βR1及siRNA瞬时干扰L428细胞Smad4的表达及对PRDM1蛋白的影响。4.统计学处理所有的实验均独立重复三次,采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差（x±SD）表示。Real-time PCR用两样本配对t检验。按P<0.05,差异具有统计学意义,P<0.01具有显著性差异。研究结果1.miR-9对L428细胞PRDM1的表达、再分化及生物学行为的影响（1）miR-9对L428细胞PRDM1表达的影响Western blot结果显示：在L428细胞中,稳定沉默miR-9的表达后,PRDM1蛋白的表达量相对于裸细胞组和空载体组明显增加,而恢复miR-9的表达后,PRDM1蛋白的表达量相对于裸细胞组和空载体组明显减少；免疫荧光共聚焦结果显示：沉默miR-9表达的L428细胞PRDM1的红色荧光相对于裸细胞组和空载体组明显增强,而恢复miR-9的表达后,PRDM1蛋白的红色荧光相对于裸细胞组和空载体组明显减弱。（2）miR-9对L428细胞形态特征和生物学特性的影响体外细胞培养普光及荧光显微镜观察可见稳定沉默miR-9的表达后L428细胞粘附成团能力明显增加；而恢复miR-9的表达后,细胞粘附性成团生长能力减弱；FRTC标记的鬼比环肽染色检测细胞骨架发现稳定沉默miR-9的表达后细胞丝足减少,皮层丝状肌动蛋白变薄,而恢复miR-9的表达后,细胞丝足增加,皮层丝状肌动蛋白稍增厚；Western blot检测结果显示稳定沉默miR-9的表达后凋亡相关蛋白Casp-9和Cleaved-Casp-3的表达量明显增加,而恢复miR-9的表达后,Casp-9和Cleared-Casp-3蛋白的表达量较明显减少。（3）稳定沉默miR-9的表达对L428细胞分化相关抗原的影响流式细胞仪发现稳定沉默miR-9表达后,浆细胞常用标记CD38和CD138以及生发中心标记CD10明显升高,而H/RS细胞的免疫特征标记（CD45在H/RS细胞的阴性表达和CD15阳性表达）CD15表达显著降低,CD45显著增高。2.miR-9的作用靶点的预测及鉴定（1）4个常用预测数据库预测miR-9相互作用的靶基因,结果显示TGF-βR1是4个软件预测的交集,荧光定量qRT-PCR结果显示TGF-β1/Smads信号通路与B细胞分化存在一定相关性,于是我们选定了TGF-βR1作为miR-9的靶基因。（2）荧光素酶报告系统检测miR-9与TGF-βR1-3’UTR结合情况,结果显示：与Mut TGF-βR1-3’UTR组、blank组、NC组相比,TGF-βR1-3’UTR野生型组与miR-9结合后的荧光素酶活性均显著增高,说明miR-9能与TGF-βR1基因3’UTR结合,从而激活了荧光素酶的活性。（3）利用荧光定量PCR检测miR-9和TGF-βR1在7种B淋巴瘤细胞株中的表达,以OCI-Ly1细胞为对照（mean±SD:1±0.000）,单因素方差分析显示,TGF-βRl在KM3和RPMI8226细胞中的表达明显高于L428细胞中的表达,miR-9在KM3和RPMI8226细胞中的表达明显低于L428细胞中的表达,且差异具有显著性。Western blot结果显示miR-9稳定沉默表达后导致TGF-βR1蛋白表达量增加,而恢复miR-9的表达后TGF-βR1蛋白的表达量减少。3. TGF-β1/Smads信号通路及其各相关成员在miR-9调控L428细胞PRDM1表达中的作用（1） Western blot结果显示,TGF-β1/Smads信号通路激活后L428细胞中PRDM1蛋白的表达增加,而TGF-β1型受体阻断剂阻断L428-miR-9-inhibitor细胞中TGF-β1/Smads信号通路后PRDM1蛋白的表达量减少；流式细胞仪发现L428细胞受重组人TGF-β1刺激后,CD45表达增高,而CD15表达降低,并出现了CD10、CD38和CD138阳性表达。（2） Western blot结果显示：分别稳定沉默miR-9的表达和重组人TGF-β1刺激因子激活L428细胞TGF-β1/Smads信号通路后,Smad3、P-Smad3、TGF-βR1和PRDM1蛋白的表达量均明显增加,Smad4的表达量减少,而Smad2的表达无明显变化。L428-miR-9-inhibitor细胞中Smad2、Smad3和TGF-βR1干扰后,其相应的Smad2、Smad3、TGF-βR1蛋白表达均明显降低,而PRDM1的表达增加；L428细胞中Smad4干扰后,Smad4表达明显降低,而PRDM1的表达增加。结论：1.miR-9负性调控PRDM1的表达诱导L428细胞再分化,并能够抑制细胞粘附性成团和细胞凋亡及调节细胞骨架的重构。2.miR-9能与TGF-βR1的3’UTR区直接结合,靶向调控TGF-βR1的表达。3.miR-9通过TGF-β1/Smad2/Smad3/Smad4信号途径调控L428细胞再分化,并且TGF-β1/Smad2/Smad3/Smad4信号通路每一个成员均能调控浆细胞分化开关蛋白PRDMl的表达。