褶纹冠蚌超氧化物歧化酶基因的原核表达及蛋白性质研究

论文摘要

褶纹冠蚌（Cristaria plicata）作为我国重要的淡水育珠蚌之一,易受病原体感染而发生疾病,育珠能力产生了较大的影响,因此开展其分子免疫的研究具有重要意义。超氧化物歧化酶（SOD）能清除生物氧化过程中所产生活性氧（ROS）而对细胞具有保护作用。本研究对褶纹冠蚌icCuZnSOD基因进行了克隆和重组表达载体构建,并对重组rCpSOD基因在大肠杆菌中进行表达和纯化,测定蛋白活性及稳定性,并初步评估其功能。本文通过利用RT-PCR结合RACE-PCR的方法克隆出褶纹冠蚌CpSOD cDNA全长,将基因和表达载体pET-30a经KpnI、EcoRI双酶切之后,连接,构建重组表达质粒。将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta-gami（DE3）中,加入IPTG时,同时加入或不加入Cu2+/Zn2+分别在37℃和20℃进行诱导,采用Ni2+亲和层析镍纯化蛋白的方法,对包涵体和可溶蛋白分别进行纯化和活性测定,并考察活性最高rCpSOD蛋白酶的热稳定性、pH稳定性和对变性剂的稳定性。用rCpSOD小鼠抗血清对诱导的融合蛋白进行Western-blot分析抗原性。最后建立乙醇损伤细胞的模型,探讨rCpSOD对乙醇损伤人L02肝细胞的保护作用。SDS-PAGE结果表明,37℃诱导表达的蛋白主要是包涵体形式,而20℃诱导则能够产生可溶性蛋白,并且在补充有Cu2+/Zn2+时有助于可溶rCpSOD的产生。进一步的SOD酶活性分析表明,不管补充Cu2+/Zn2+诱导与否,在37℃和20℃诱导的包涵体蛋白复性后活性都低于1000U/mg,且20℃比37℃诱导的包涵体蛋白活性低；20℃诱导产生的可溶蛋白酶活性则明显升高,补充Cu2+/Zn2+诱导产生的rCpSOD酶活性最高,达5300 U/mg,说明在低温培养及补充Cu2+/Zn2+时有利于可溶rCpSOD的体外诱导表达并且有利于其酶活性的提高。纯化的可溶性rCpSOD蛋白在温度60℃和pH 2-9内活性稳定,并可耐受8mol·L-1的尿素和8%的十二烷基硫酸钠（SDS）。制备鼠rCpSOD的多抗血清,经Western blotting分析,目的基因SOD的表达产物能够被鼠多克隆抗体特异性识别。此外,在乙醇损伤人L02肝细胞模型中,结果表明有活性的rCpSOD酶可以保护L02肝细胞免受氧化损伤。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 目录
• 第一章 综述
• 1.贝类免疫研究概述
• 1.1 贝类的细胞防御机制
• 1.2 贝类的体液防御机制
• 2.超氧化物歧化酶基因研究现状
• 2.1 SOD的发现
• 2.2 SOD的种类和结构
• 2.3 SOD的理化性质和作用机理
• 2.4 SOD的活性测定及影响因素
• 2.5 氧化酶对乙醇损伤肝细胞的保护作用
• 2.6 SOD的应用
• 3.本研究的意义
• 第二章 利用E.coli表达系统制备褶纹冠蚌重组CuZn-SOD蛋白
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 酶、引物
• 2.1.4 试剂与仪器设备
• 2.1.5 E.coli感受态细胞的制备
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 RNA的提取
• 2.2.2 cDNA的合成
• 2.2.3 CpSOD基因的扩增
• 2.2.4 SOD-T亚克隆载体的构建
• 2.2.5 测序及序列分析
• 2.2.6 表达载体的构建与鉴定
• 2.2.7 重组SOD蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
• 2.2.8 可溶性重组CpSOD蛋白诱导表达条件的优化
• 2.3 结果
• 2.3.1 总RNA的提取
• 2.3.2 RT-PCR
• 2.3.3 SOD-T载体的菌落PCR及酶切鉴定
• 2.3.4 重组rCpSOD表达载体的构建
• 2.3.5 重组rCpSOD蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析
• 2.3.6 可溶rCpSOD蛋白诱导表达条件的优化
• 2.4 讨论
• 第三章 褶纹冠蚌重组SOD蛋白的纯化和活性测定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 主要仪器设备
• 3.1.2 菌株和试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 rCpSOD蛋白的表达纯化及含量测定
• 3.2.2 rCpSOD酶活性测定
• 3.2.3 温度、pH、变性剂对纯化好的天然形式可溶rCpSOD蛋白活性的影响
• 3.2.4 黑鼠多克隆抗体的制备
• 3.2.5 ELISA测定血清抗体效价
• 3.2.6 rCpSOD蛋白的Western免疫验证
• 3.3 结果
• 3.3.1 rCpSOD蛋白的纯化
• 3.3.2 rCpSOD蛋白浓度测定
• 3.3.3 rCpSOD蛋白酶活性测定
• 3.3.4 温度、pH和变性剂可溶rCpSOD蛋白酶活性的影响
• 3.3.5 ELISA测定血清抗体效价
• 3.3.6 Western验证
• 3.4 讨论
• 第四章 可溶rCpSOD蛋白对人L02肝细胞的保护作用研究
• 4.1 实验试剂与仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 人L02肝细胞的复苏和培养
• 4.2.2 乙醇损伤L02肝细胞模型的建立
• 4.2.3 rCpSOD对乙醇所致人L02肝细胞氧化损伤的保护作用
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 乙醇损伤L02细胞半致死浓度（IC50）的确定
• 4.3.2 IC50的乙醇浓度在不同时刻对L02细胞损伤情况
• 4.3.3 rCpSOD蛋白对乙醇所致人L02肝细胞氧化损伤的保护作用
• 4.4 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录1 实验室常规培养基及分子生物学试剂
• 附录2 常规免疫学检测试剂
• 攻读学位期间的研究成果