论文摘要
海藻糖是一种非还原性二糖分子，它可在干燥、脱水、热胁迫、冷胁迫、氧化胁迫、渗透压胁迫等多种胁迫环境下对生命体起保护作用，广泛存在于除高等动物以外的生命体中。otsA／otsB途径是生命体合成海藻糖的主要途径，otsA基因编码海藻糖-6-磷酸合成酶，它以葡萄糖-6-磷酸和UDP-葡萄糖作为底物，生成海藻糖6-磷酸和UDP。OtsB催化海藻糖-6-磷酸生成海藻糖。UDP-葡萄糖在冷信号传导中起重要作用，海藻糖-6-磷酸调控着体内糖的代谢，都对生命体在逆境中的存活与生长起重要作用，它们分别是OtsA的底物和产物，因此研究不同生长环境中的生命体的OtsA催化效率具有重要意义。本实验所用实验材料为节杆菌和大肠杆菌，此株节杆菌为耐冷菌，其OtsA与中温菌大肠杆菌的OtsA作酶动力学比较，通过不同温度下一系列酶学参数的分析，得出节杆菌OtsA在低温下较之大肠杆菌的优越性，从而为研究耐冷菌的耐冷机制奠定基础。利用PCR技术扩增出大肠杆菌和节杆菌中的otsA基因，连接入T载体，转入大肠杆菌DH5α，再用限制性内切酶将基因片段切下，连接入pET表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导后，工程菌大量表达重组蛋白。利用亲和层析法分离纯化目的蛋白，并对其催化活性进行测定。通过分析对比低温下不同物种间OtsA的催化效率，得出节杆菌的OtsA比大肠杆菌的更适应低温环境，这个适应性主要取决于对UDP-葡萄糖的亲和度（体现在米氏常数Km上），而不取决于酶的转换数（Kcat）。温度由30℃降至16℃时，大肠杆菌OtsA Km由4.3599上升至9.5891，节杆菌OtsA Km由10.6766下降至2.2331，Kcat则呈无规则波动，由此推论：节杆菌比大肠杆菌更适应低温环境，一部分原因是由于其海藻糖-6-磷酸合成酶（OtsA）在低温下对UDP-葡萄糖的亲和度更高。