论文摘要
研究背景骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种以骨强度降低，骨脆性增加，易至骨折为主要特征的代谢性骨病。它是一种多发于中老年人的疾病，它可导致骨强度减弱和骨折发生率增高，它是引起老年人腰腿痛、脊柱变形及骨折的主要病因。随着我国逐渐步入老龄化社会，患原发性骨质疏松症（primary osteoporosis，POP）的患者将会越来越多。研究有效防治OP的药物和防治方法以及对其防治机制的研究是医学界的热点。OP以破骨细胞（osteoclast，OC）活化增殖，骨吸收大于骨形成为主要特点，而骨折是OP最危险的并发症。因此任何影响到OC或成骨细胞（osteoblast，OB）功能的因素都有可能与OP的发生有关，同时，任何影响到骨骼结构成分的因素也有可能影响到骨强度，改变骨质量，导致OP的发生发展，它们可改变骨的生物力学性能，降低骨的柔韧性和强度而导致骨折的发生。近年来发现OB表达的护骨素（osteoprotegerin，OPG）、护骨素配体（receptor activator of nuclear factor-KB ligand，RANKL）有调节OC的作用，抑制骨吸收。OP的发生同时还与众多细胞因子如白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白细胞介素-4（interleukin-4，IL-4）等的释放有关，它们相互作用，共同调节着OC与OB的功能。Ⅰ型胶原是人体内含量最丰富的胶原类型，它是构成骨的重要成分，其结构及数量改变与OP的发生、发展、严重程度密切相关。Ⅰ型前胶原羧基端前肽（carboxyterminal propeptide of type I procollagen，PICP）是OB合成并释出前胶原纤维的细胞外分解产物，其在血循环中的含量主要反映Ⅰ型胶原的合成速率，升高提示Ⅰ型胶原合成速率加快，Ⅰ型胶原合成可增加骨的韧性和强度。中医理论认为“肾藏精，主骨，生髓”，“髓者，肾精所生，精足则髓足，髓足骨内，髓足者则骨强。”肾中精气充盈，则骨髓生化有源，骨才能得到骨髓的滋养，骨骼强壮。若肾中精气亏虚，骨失所养，骨骼脆弱，则会导致OP，故治疗OP以补肾为主。根据上述理论，本课题组选用骨碎补、鹿茸等补肾阳、强筋骨中药组成了复方制剂一骨灵丸，在临床上用于治疗OP并取得了显著的疗效。既往研究显示其可明显对抗OP大鼠出现的骨丢失，维护骨强度，保持骨生物力学性能，有效防治OP。为了提高疗效，我们改良剂型为骨灵片，并进一步为中医药的开发利用及发展提供理论基础，本文通过研究骨灵片对OP动物模型血清中OPG、RANKL、PICP以及IL-6、TNF-α、IL-4的变化，进一步阐明骨灵片防治OP的机制。研究目的探讨骨灵片对OP大鼠血清OPG／RANKL及细胞因子（IL-4、IL-6、TNF-α）以及PICP表达水平的影响，从分子水平角度阐明骨灵片对骨代谢以及骨强度的影响，进一步阐明骨灵片防治OP的作用机制。方法1．药物的制备骨灵片液根据骨灵片处方（由骨碎补、鹿茸等组成），采用人服用药物同批药材，按骨灵片提取工艺经乙醇提取和水提取方法最大效量提取有效成分，过滤浓缩为终浓度为1g生药／ml，由南方医科大学中药制剂室提供。2．实验分组取3月龄成熟Sprague dawley（SD）系SPF级大鼠50只，雌雄各半。将大鼠随机分为5组，即正常对照组（假手术组，sham-operated group，Control group）、模型组（Model group）、骨灵片（Gu Ling Pian，GLP）高剂量组（high dozes group，HDG）、骨灵片中剂量组（middle dozes group，MDG）、骨灵片低剂量组（low dozesgroup，LDG）。3．OP模型的建立采用去势法建立大鼠OP模型，即雌性鼠去除卵巢，雄性鼠去除睾丸的手术方法。4．喂饲药物造模手术后1月，各组大鼠均等体积灌胃饲养，其中空白对照组和模型组给予生理盐水，骨灵片组根据人鼠剂量换算标准，给予骨灵片以高（5．40g．kg-1．d-1）、中（2．70 g．kg-1．d-1）、低（1．35 g．kg-1．d-1）剂量灌胃，各组给药剂量均按临床等效剂量换算。5．OPG、RANKL、PICP及IL-6、TNF-α、IL-4的检测大鼠灌药后3月，心脏采血，4℃、3000rpm/min离心10min后血清保存于-20℃冰箱中待检测，操作均按ELISA试剂盒说明书进行。6．统计学处理数据均以SPSS13．0数据统计软件包处理，结果以均数±标准差（（?）±S）表示，采用Oneway-ANOVA分析，方差齐性检验，组间比较使用LSD方法进行数据的处理：方差不齐检验，采用T2方法处理。P<0．05表示有统计学意义。结果1．造模后4月，各组OPG表达水平的总体比较具有显著性差异（F=19．800P<0．001）。模型组（1．54±0．41ng/ml）的OPG表达水平显著高于正常组（0．36±0．35ng／ml）（P<0．001），骨灵片高（4．73±2．66ng／ml）、中（3．65±2．07ng／ml）、低（3．37±1．50ng／ml）剂量组的OPG表达显著高于模型组（P<0．05，P<0．01），且骨灵片3个剂量组的OPG表达显著高于正常组（P<0．05，P<0．01），而骨灵片3个剂量组之间两两比较无显著性差异（P>0．05）。2．各组大鼠的RANKL表达水平总体比较具有显著性差异（F=30．693，P<0．001）。模型组（83．00±14．54pg／ml）的RANKL表达显著高于正常组（12．05±9．64pg／ml）（P<0．01），而骨灵片高（26．32±9．86pg／ml）、中（26．27±19．11pg／ml）、低（25．81±7．74pg／ml）剂量组RANKL表达显著低于模型组（P<0．01）。骨灵片3个剂量组的RANKL表达显著高于正常组（P<0．05），但骨灵片3个剂量组之间两两比较无统计学意义（P>0．05）。3．各组IL-6表达水平总体比较具有显著性差异（F=3．874，P=0．005）。模型组（24．06±7．58 pg／ml）的IL-6表达显著高于正常组（15．73±5．62 pg／ml）（P<0．01），骨灵片高（14．67±5．18 pg／ml）、中（15．74±5．60 pg／ml）、低（15．61±4．77 pg／ml）剂量组的IL-6表达均显著低于模型组（P<0．01），而骨灵片3个剂量组与正常组比较，无显著性差异（P>0．05），且骨灵片3个剂量组之间两两比较无显著性差异（P>0．05）。4．各组TNF-α表达水平总体比较具有显著性差异（F=2．569，P=0．038）。模型组（21．19±5．81pg／ml）的TNF-α表达显著高于正常组（16．62±6．48pg/ml）（P<0．05），而骨灵片高（13．92±4．75 pg／ml）、中（15．13±4．22 pg／ml）、低（16．65±3．60pg／ml）剂量组TNF-α表达均低于模型组，其中骨灵片3个剂量组与模型组比较有显著性差异（P<0．05，P<0．01），骨灵片3个剂量组与正常组比较无显著性差异（P>0．05），且骨灵片3个剂量组之间两两比较无显著性差异（P>0．05）。5.各组大鼠IL-4表达水平总体比较具有显著性差异（F=21．504，P<0．001）。模型组（3．40±1．46 pg／ml）的IL-4表达显著低于正常组（4．93±1．49 pg／ml）（P<0．05），但骨灵片高（5．22±2．26 pg／ml）、中（5．03±1．93 pg／ml）、低（4．61±1．14pg／ml）剂量组的IL-4表达均高于模型组，其中骨灵片高、中剂量组与模型组比较具有显著性差异（P<0．05），但骨灵片低剂量组与模型组比较无统计学意义（P>0．05），而骨灵片3个剂量组的IL-4表达与正常组比较无显著性差异（P>0．05），骨灵片3个剂量组之间两两比较无显著性差异（P>0．05）。6．各组大鼠PICP表达水平的总体比较具有显著性差异（F=28．950，P<0．001）。模型组（2．48±1．58ng／ml）血清中的PICP表达低于正常组（6．85±3．74ng／ml）但无统计学差异（P>0．05），而骨灵片高（16．75±6．25ng／ml）、中（15．74±4．22ng／ml）、低（11．98±4．67ng/ml）剂量组显著高于模型组（P<0．01），且骨灵片高、中剂量组显著高于正常组（P<0．01，P<0．05），但骨灵片低剂量组与正常组比较无显著性差异（P>0．05）。而骨灵片各用药组之间PICP的浓度随用药剂量的增加而增加，且骨灵片3个剂量组之间两两比较无统计学意义（P>0．05）。结论1、去势后大鼠可通过上调血清中OPG的表达水平来对抗OP，但RANKL的表达也明显上调，且上调水平远远超过OPG表达的水平，故OPG／RANKL比值仍然下降，同时机体内骨吸收刺激因子IL-6、TNF-α表达水平上升，IL-4表达水平下降，并且血清PICP表达水平下降，以上细胞因子的共同作用与OP的发生有关。2、骨灵片可上调OPG表达水平，下调RANKL的表达水平，使OPG／RANKL比值增加，同时骨灵片亦可调整细胞因子如IL-6、TNF-α、IL-4的表达水平。提示骨灵片可通过OPG／RANKL比值及相关细胞因子调节骨代谢。3、另一方面骨灵片还可上调血清中PICP的表达水平，这可能是骨灵片影响骨强度，保持骨生物力学性能的机制之一。
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标签：骨灵片论文; 骨质疏松论文; 护骨素论文; 型前胶原羧基端前肽论文; 细胞因子论文;