论文摘要
钙蛋白酶（calpains, CAPNs）家族是一类钙依赖的在各种生物学过程发挥作用的半胱氨酸蛋白酶,该家族根据其蛋白结构的不同分为两类,即经典型和非经典型CAPNs。经典型CAPNs包括CAPN 1、2、3、8、9和11,蛋白结构中含有一个penta-EF手型结构域,该类型表达广泛,参与了细胞的各种活动如转移、凋亡、增殖和细胞周期的调控等。非经典型CAPNs蛋白结构中没有penta-EF手型结构域,包括CAPN5、6、7、10、12和14, CAPN6是该家族的成员之一,位于X染色体。文献曾报道CAPN6的表达有组织特异性,CAPN6 mRNA在胚胎表达很高,而在出生后的CAPN6强烈下调,但发现CAPN6在子宫肉瘤和癌肉瘤（carcinosarcoma）组织高表达。研究结果显示CAPN6是一种微管稳定蛋白,参与微管的动力学和细胞骨架的重组,也可通过抑制细胞的凋亡和有助于血管的形成而促进肿瘤的发生。上述研究结果提示CAPN6可能在肿瘤的发生发展中发挥作用,但总起来说研究甚少,关于CAPN6的基因表达调控至今没有报道。我们实验室的基因芯片结果显示在过表达Akt的小鼠成纤维细胞CAPN6 mRNA显著上调,推测CAPN6表达可能受PI3K-Akt调控,并对此进行了深入研究。本文第一部分研究PI3K-Akt对CAPN6蛋白及mRNA表达的调控,结果证明PI3K-Akt能够上调CAPN6蛋白及mRNA表达。应用P13K抑制剂LY294002处理肿瘤细胞发现随着时间延长CAPN6蛋白逐渐下降。用IGF-1处理HeLa细胞不同时间发现随时间延长Akt磷酸化水平逐渐升高,CAPN6蛋白也表达增加,说明IGF-1能激活Akt从而促进CAPN6表达。用下调HeLa细胞PTEN表达后,发现Akt磷酸化水平增加,CAPN6蛋白水平增加。在稳定下调Akt的7404细胞CAPN6表达下降,用Akt抑制剂处理7404细胞也发现CAPN6蛋白下调。应用Real-time RT-PCR方法证明LY294002处理肿瘤细胞后CAPN6 mRNA水平下降,还证实CAPN6 mRNA在过表达Akt的MEF细胞比对照组的细胞CAPN6 mRNA水平显著增加,用LY294002处理后下降。在下调Ak1或Akt2的7404细胞中CAPN6 mRNA显著降低。本部分证明了PI3K-Akt能上调CAPN6表达,此外还发现PI3K-Akt通过GSK-3p调控CAPN6的表达。为进一步研究PI3K-Akt信号通路对内源性CAPN6蛋白表达的分子机制。在第二部分,首先用P13K抑制剂LY294002处理细胞,后用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞,用Western blot的方法检测CAPN6蛋白水平发现LY294002能缩短内源性CAPN6的半衰期,降低其稳定性。为研究Akt在蛋白质稳定性中起的作用,稳定下调Akt表达后的结果显示Akt不影响CAPN6的稳定性。用GSK-3β抑制剂LiCl或mTOR抑制剂Rapamycin与CHX处理细胞作用不同时间点发现LiCl能降低CAPN6半衰期。用LY294002、LiCl或Rapamycin与蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞后检测CAPN6蛋白,发现LY294002与LiCl可促进蛋白酶体介导的CAPN6降解,但Rapamycin不影响此过程。上述结果说明PI3K-Akt可能通过提同CAPN6蛋白质的稳定性和抑制蛋白酶体对其的降解而增加其表达。为深入研究PI3K-Akt信号通路调控CAPN6基因表达的分子机制,本文第三部分研究PI3K-Akt信号通路对CAPN6基因表达转录机制的调控。首先扩增一系列长度不同的CAPN6启动子,将其克隆到荧光素酶报告质粒pGL3-Basic上游,经测序比对正确后,选择构建成功载体进行下一步研究。用瞬时转染方法及双荧光素酶检测系统研究启动子质粒在7404、HeLa和293T细胞中的CAPN6启动子活性,发现-93/+200bp片段的启动子活性最强。随后观察LY294002对该片段启动子活性影响,发现LY294002能够降低CAPN6启动子活性；下调Akt1或Akt2能降低CAPN6基因启动子活性。上述结果说明PI3K-Akt能在转录水平上调CAPN6基因的表达。为研究哪些可能的转录因子参与了CAPN6的转录调控,用启动子预测软件分析-93/+200bp片段的转录因子结合位点,从中选择了一些转录因子结合位点并将其进行点突变,并构建点突变的启动子荧光素酶报告质粒,将其瞬时转染HeLa和7404细胞中发现将AP1、FoxD3、Oct-1和HNF-3β等结合位点突变后CAPN6基因活性下降。之后将-93/+200bp片段的启动子质粒与AP1、FoxD3或Oct-1 siRNA共转染后检测启动子活性,发现将下调上述转录因子表达后启动子活性仍然下降,蛋白和mRNA水平都分别有不同程度下降,说明AP1、FoxD3和Oct-1都能在转录和转录后水平调控CAPN6的表达。应用CHIP的方法进一步证明了AP1、FoxD3和Oct-1能与CAPN6基因启动子结合。本文第四部分研究CAPN6的一些细胞生物学功能。应用细胞克隆形成和细胞周期的实验方法观察CAPN6对肿瘤细胞增殖能力的影响,将下调CAPN6表达能抑制HeLa和7404细胞的增殖,还发现CAPN6能抑制细胞凋亡,但可能不参与癌细胞迁移,与EMT无关。综上所述,本文首次研究并发现PI3K-Akt信号通路能在转录和转录后水平上调CAPN6的表达及部分的生物学功能。这一发现对认识CAPN6基因在肿瘤发生发展的机制及其作用具有重要意义。
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