兔骨形态发生蛋白15基因的克隆与蛋白的定位分析

论文摘要

BMP15基因是卵母细胞分泌因子重要成员之一,其在卵泡发育和卵母细胞成熟过程中发挥重要作用。目前,有关BMP15基因的研究主要集中于人、山羊、牛、猪等,而尚未见兔BMP15基因的研究报道。因此,本文预通过对兔BMP15基因的克隆、蛋白定位及表达研究,探讨BMP15在兔生殖系统中所发挥的作用。根据GenBank公布的其它物种的BMP15基因序列合成引物,采用RT-PCR法从新西兰大白兔卵母细胞中克隆出卵母细胞分泌因子BMP15基因部分cDNA片段,并进行测序。结果显示,所克隆的BMP15基因总扩增片段为919bp,横跨外显子Ⅰ、Ⅱ,经blast比对,该序列与猪、牛、绵羊、山羊、人和小鼠的BMP15基因cDNA相应的同源性分别为83%、82%、82%、82%、80%和75%,为分离、克隆兔BMP15基因全序列提供了可能。根据兔GAPDH cDNA序列设计引物,以其PCR产物作为内标,分别以兔各个组织反转录产物为模板,通过半定量RT-PCR检测了BMP15 mRNA在兔多个组织中的表达情况,结果发现BMP15除了在卵巢、睾丸中表达外,还在下丘脑、垂体等非性腺组织中表达,预示着BMP15在这些非性腺组织中也可能发挥了一定的功能。采用免疫组化技术测定BMP15蛋白在性腺中的定位,结果显示:BMP15蛋白在兔卵巢初级卵泡、次级卵泡和有腔卵泡卵母细胞中均有高度表达,表明BMP15蛋白在启动卵泡发育后的整个过程中都发挥一定的作用。同时,在卵泡腔中也检测到该蛋白的表达,卵母细胞可能将该蛋白分泌至卵泡腔中,进而调节卵泡的发育。此外,还首次在哺乳动物黄体中发现了该蛋白的表达,推测可能由于物种差异,但该蛋白可能为黄体所分泌的卵泡抑素所拮抗,故不发挥作用。在睾丸中的定位结果显示,BMP15蛋白特异性表达于兔睾丸的精原细胞和圆形精子细胞,可见在精子的形成过程中起一定的调控作用。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1. 引言
• 2. BMP15 的生物学作用
• 3. BMP15的信号通道
• 4. BMP15 在哺乳动物生殖中的作用
• 5. 结论
• 参考文献
• 第二章 兔BMP15 基因CDNA 的克隆及序列分析
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 2. 结果与分析
• 2.1 兔总RNA 的检测
• 2.2 兔BMP15 部分编码区序列的一次RT-PCR 扩增
• 2.3 兔BMP15 部分编码区序列的二次RT-PCR 扩增
• 3. 讨论
• 参考文献
• 第三章 兔BMP15 在组织中的表达及免疫组化定位
• 1. 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 方法
• 2. 结果
• 2.1 兔 BMP15 基因 mRNA 的表达
• 2.2 BMP15 蛋白在兔性腺中的定位
• 3. 讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文