中国捕鸟蛛毒素的基因克隆、表达及结构与功能关系的研究

论文摘要

虎纹捕鸟蛛（Ornithoctonus huwena Wang）是分布在我国广西省和云南省山区的一种稀有蜘蛛新种,在本实验室以前的工作中,从虎纹捕鸟蛛的粗毒中分离出了具有不同结构和功能的多种成分,并且已经克隆了其中9种毒素的cDNA,将其分为三个超家族。本文采用RACE方法克隆了HWTX-Ⅴ的cDNA,并将其归类于超家族中。根据毒素的氨基酸序列设计RACE引物,通过叠合3’RACE和5’RACE扩增的序列就得到了毒素蛋白的cDNA全序列。HWTX-Ⅴ的全长cDNA共有459个碱基。由5’UTR、可读框和3’UTR组成,将其与其它虎纹捕鸟蛛的毒素（HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅱ,HWTX-Ⅲ,HWTX-Ⅳ,HWTX-Ⅶ）cDNA进行同源比较,同时将Pre和Pro区与其他已知毒素的Pre和Pro区比较,结果表明HWTX-Ⅴ的核苷酸序列在Pre和Pro区与HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅲ,HWTX-Ⅳ高度同源,而与HWTX-Ⅱ,HWTX-Ⅶ的同源性较低。由此可知HWTX-Ⅴ,HWTX-Ⅰ,HWTX-Ⅳ属同一超家族,从而可以预测HWTX-Ⅴ的三级结构同HWTX-Ⅰ一样,六个半胱氨酸残基都通过C1-C4,C2-C5,C3-C6的配对方式形成抑制剂半胱氨酸结模体（inhibitor Cystine knot,ICK）。HWTX-Ⅴ的cDNA可读框编码86个氨基酸残基的毒素前体,包括N端的50个氨基酸残基组成的信号肽和间隔区,中间35个氨基酸残基组成的成熟毒素,以及C端的额外碱性氨基酸Lys。尾端的Lys在毒素前体的成熟过程中被切除。 敬钊缨毛蛛（Chilobrachis jingzhao）属于捕鸟蛛科,是分布于我国海南省山区的一种蜘蛛新种。本实验室以前的工作中,已经测定了约20种毒素的一级结构。本文采用RACE方法克隆了5种敬钊缨毛蛛的全长cDNA序列,它们都由5’UTR、可读框和3’UTR组成,其开放阅读框编码一个20-23个氨基酸残基组成的信号肽区域,一个30多个氨基酸残基组成的成熟蛋白区域和一个介于它们之间的pro区域构成的毒素前体。这几种毒素的pro区变化较大,从几个氨基酸残基（JZTX-Ⅰ,Ⅲ,Ⅶ）到30多个（JZTX-Ⅸ）氨基酸残基不等,且它们的同源性较低。 蜘蛛毒素蛋白由于其序列短而富含二硫键,所以采用基因工程的方法表达困难,本文采用原核分泌表达载体pMAL-p2X成功表达了HWTX-Ⅳ,

论文目录

• 缩写表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 蜘蛛肽类毒素的分子生物学研究进展
• 1.蜘蛛肽类神经毒素
• 2.蜘蛛肽类神经毒素基因的克隆
• 3.蜘蛛肽类神经毒素基因的结构
• 4.蜘蛛肽类神经毒素基因的表达
• 5.蜘蛛肽类毒素基因克隆及表达的问题与展望
• 第二章 蜘蛛毒素的cDNA克隆
• 1.前言
• 2.材料和试剂、仪器
• 3.方法
• 4.结果与分析
• 5.讨论
• 第三章 HWTX-Ⅳ在大肠杆菌中的分泌表达
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 第四章 敬钊缨毛蛛毒素组学研究
• 1.前言
• 2.材料与方法
• 3.结果
• 4.讨论
• 进一步研究设想
• 小结
• 附录：穴居狼蛛抗菌肽Ⅰ（LSAP-Ⅰ）的阶段性研究结果
• 参考文献
• 论文发表
• 致谢
• 原创性声明