典型养殖水体中细菌群落结构的DGGE分析及其与环境因子相关性研究

论文摘要

对虾养殖是我国水产养殖的支柱产业之一,随着水产养殖结构的调整及可持续性发展道路的要求,走生态养殖道路迫在眉睫。水体生态环境优劣是水产养殖成败的关键,水体理化因子与微生物,以及水生生物之间的关系,对形成良性循环的健康生态养殖体系有至关重要的作用。因此,研究养殖水体中各因素之间的变化规律,对水产业的发展有着重大的意义。本文针对珠三角地区典型对虾养殖水体建立了PCR-DGGE技术实验平台,并将优化后的方法应用于研究养殖水的时空变化取样,最终通过对DGGE指纹图谱的分析结合统计学分析方法,对菌群结构变化规律及其与对应理化指标的关系进行了初步探讨。为今后对养殖水体的细化研究奠定了方法基础,提供了参考数据。主要结果如下:a.优化了针对养殖水样的全套PCR-DGGE系统方法,有效地提高了电泳图谱的效果:采用CTAB法提取总DNA,确定了降落式PCR（td-PCR）的较优条件,DGGE变性剂梯度范围为40%～55%,在电压75V温度57℃下电泳18小时左右,并采用银染法染色及克隆测序。b.应用Quantity One软件对DGGE图谱进行排除背景干扰,识别泳道条带,全自动相对定量和相似性分析,平行样品证明了DGGE实验能够区分养殖水样中细微差别的样品,并且有良好的复现性。c.利用优化后的PCR-DGGE系统方法对不同时空的养殖水样本进行了检测,DGGE指纹图谱分析显示,对虾养殖水体中微生物结构复杂,不同时空的样品在菌群结构和含量上都有较大变化。d. UPGMA聚类分析和多维尺度分析（MDS）的结果显示,在一定程度上时间变化比空间差异对菌落结构影响更大。此外,不同时间样品按顺序的类聚,反映出同一养殖场的细菌群落组成随时间推移很可能产生了连贯性的变化,而微生物制剂可能对菌落结构有较大影响。e.对DGGE图谱中条带的回收测序显示,β-变形菌纲、α-变形菌纲、芽孢杆菌纲和梭菌纲很可能是样品养殖水中的优势菌种。硝化螺旋菌、双歧杆菌、硝化杆菌、脱硫弧菌、蛭弧菌可能是养殖水中的常见菌种。检测到的细菌大部分为不可培养菌种,而它们之间的亲缘关系都比较远。f.应用主成分分析（PCA）和典型相应分析（CCA）结果显示,本研究所选取的理化指标基本涵盖了与细菌种群相关性较高的所有环境因素的信息（94%和76%）,这些理化指标相关性较高,可以归纳为三、四个主成分因素。而温度、pH值、氨氮、总磷、叶绿素a、溶氧、亚硝酸盐和透明度在本研究中对养殖水细菌群落结构起着非常重要的作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 珠三角地区对虾养殖现状及面临的问题
• 1.1.1 珠三角地区对虾养殖现状
• 1.1.2 珠三角地区对虾养殖面临的问题
• 1.2 国内外养殖水研究的现状
• 1.2.1 国内研究进展
• 1.2.2 国外研究进展
• 1.3 PCR-DGGE 指纹图谱技术
• 1.3.1 PCR-DGGE 技术的基本原理
• 1.3.2 PCR-DGGE 技术的系统优化
• 1.3.3 DGGE 指纹图谱的分析
• 1.4 PCR-DGGE 在环境微生物方面的应用
• 1.4.1 微生物种群的多样性研究
• 1.4.2 动态监测环境中微生物的变化
• 1.4.3 PCR-DGGE 用于环境微生物检测的局限性及改进
• 1.5 本研究的目的和内容
• 1.5.1 本研究的目的
• 1.5.2 本研究的内容
• 第二章 PCR-DGGE 检测养殖水的平台建立及优化
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 样本的采集与预处理
• 2.1.2 总DNA 的提取
• 2.1.3 PCR 条件的优化
• 2.1.4 DGGE 条件的优化
• 2.1.5 DGGE 指纹图谱的分析
• 2.1.6 显著条带回收纯化并构建克隆文库测序
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 总DNA 提取结果
• 2.2.2 PCR 优化结果
• 2.2.3 DGGE 优化结果
• 2.2.4 DGGE 指纹图谱的分析
• 2.2.5 显著条带回收纯化并构建克隆文库测序
• 2.3 本章小结
• 第三章 DGGE 检测养殖水中微生物菌群结构的时空变化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 样品的采集
• 3.1.2 PCR-DGGE 检测菌群结构的方法
• 3.2 DGGE 检测不同空间养殖水中的微生物菌群结构
• 3.2.1 总DNA 的提取结果
• 3.2.2 降落式PCR 的结果
• 3.2.3 DGGE 指纹图谱分析
• 3.2.4 显著条带回收测序
• 3.2.5 统计学分析
• 3.3 DGGE 检测养殖周期内水中微生物菌群结构的变化
• 3.3.1 总DNA 的提取结果
• 3.3.2 PCR 的结果
• 3.3.3 DGGE 的结果
• 3.3.4 显著条带回收测序
• 3.3.5 统计学分析
• 3.4 本章小结
• 第四章 养殖水理化指标的变化及其与菌落结构的关系
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 理化指标的选取
• 4.1.2 理化指标的检测方法
• 4.2 理化指标检测结果
• 4.2.1 不同空间养殖水理化指标的变化
• 4.2.2 养殖周期内理化指标的动态变化
• 4.3 理化指标的统计学分析
• 4.3.1 不同空间水样理化性质的主成分分析
• 4.3.2 养殖周期内理化指标动态变化的主成分分析
• 4.4 细菌群落结构与环境因子的典型对应分析
• 4.4.1 不同空间样品CCA 分析
• 4.4.2 随时间变化样品的CCA 分析
• 4.5 本章小结
• 结论与展望
• 创新点
• 主要结论
• 展望
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间取得的研究成果
• 致谢