微囊化尿酸氧化酶工程菌的制备及应用

论文摘要

微囊包裹表达特定酶的微生物可用于口服治疗某些代谢性疾病(如高尿酸、高胆固醇以及肿瘤辅助治疗等等)。微囊隔离有效避免了胃肠道对微生物的伤害,及机体免疫反应的发生。但是如果微生物从微囊中释放出来并在肠道内增殖,将可能破坏肠道内菌群平衡,危害人体健康。文献报道均从如何加强微囊强度入手,目前尚未获得理想结果。本课题设想采用灭活微生物的方法来彻底避免此类问题。为证实这一设想的可行性,我们以本室构建的表达尿酸氧化酶的E.coli BL21(DE3)基因工程重组菌株UO20为研究对象,经过发酵培养诱导尿酸氧化酶的胞内表达;采用甲醛灭活的方法处理菌体使其丧失增殖能力,同时使该菌株保持一定的降解尿酸能力,制备不可繁殖型尿酸氧化酶工程菌;随后采用气流喷雾法包裹已灭活的工程菌制备微囊,并对微囊制备过程中的一些工艺参数进行了考察,证明这种微囊化灭活工程菌具有体外降尿酸的能力;用次黄嘌呤腹腔注射的方法建立了小鼠高尿酸血症病理模型;并进行了微囊化不可繁殖型工程菌的体内作用效果检测;在此基础上,将含灭活菌体的微囊冻干保存,进一步研究微囊化不可繁殖型工程菌在使用不同冻干保护剂及不同保存条件下的稳定性,为其今后应用于口服治疗提供了一定的基础,并对其它微生物代谢治疗剂的研究提供借鉴。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 一、高尿酸血症的危害及治疗方法
• 二、微囊化不可繁殖型基因工程菌
• 三、动物高尿酸血症病理模型
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株及载体
• 2.1.2 试剂盒
• 2.1.3 蛋白分子量标准
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要试剂
• 2.1.6 主要溶液
• 2.1.7 主要培养基
• 2.1.8 实验用动物
• 2.1.9 取血容器及工具的前处理
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 工程菌培养及尿酸氧化酶表达
• 2.2.2 工程菌尿酸氧化酶活性测定方法的建立
• 2.2.2.1 方法一、紫外吸收法
• 2.2.2.2 方法二、用尿酸试剂盒检测
• 2.2.3 工程菌甲醛灭活条件考察
• 2.2.3.1 不同灭活条件对工程菌酶活的影响
• 2.2.3.2 甲醛灭活对繁殖性的影响
• 2.2.3.3 甲醛灭活对菌体形态的影响
• 2.2.4 微囊化菌体的制备
• 2.2.4.1 微囊制备条件的考察
• 2.2.4.1.1 微囊制备原理
• 2.2.4.1.2 微囊制备实验流程
• 2.2.4.1.3 微囊制备条件考察
• 2.2.4.2 微囊理化性质
• 2.2.4.2.1 微囊粒径
• 2.2.4.2.2 微囊包封率
• 2.2.4.2.3 微囊强度
• 2.2.4.3 微囊化菌体体外降尿酸活性检测
• 2.2.5 高尿酸血症病理模型的建立
• 2.2.5.1 大鼠肾衰模型
• 2.2.5.2 小鼠高尿酸血症病理模型
• 2.2.6 微囊体内活性检测
• 2.2.6.1 微囊灌胃体内分布情况
• 2.2.6.2 微囊体内作用效果
• 2.2.7 微囊冻干保护剂的考察
• 第三章 结果
• 3.1 尿酸氧化酶的表达
• 3.2 工程菌尿酸氧化酶活性测定方法
• 3.2.1 方法一检测结果
• 3.2.2 方法二检测结果
• 3.3 灭活条件对工程菌活性影响
• 3.3.1 灭活条件对工程菌酶活的影响
• 3.3.2 灭活条件对工程菌繁殖性的影响
• 3.3.3 甲醛灭活条件对菌体形态的影响
• 3.4 微囊化菌体的制备
• 3.4.1 微囊制备条件考察
• 2浓度的考察'>3.4.1.1 海藻酸钠溶液粘度及CaCl₂浓度的考察
• 3.4.1.2 通气流速及泵转速的考察
• 3.4.2 微囊的理化性质
• 3.4.2.1 微囊粒径
• 3.4.2.2 微囊包封率
• 3.4.2.3 微囊强度
• 3.4.2.4 微囊化菌体体外降尿酸活性检测
• 3.5 高尿酸血症病理模型
• 3.5.1 大鼠肾衰模型
• 3.5.2 小鼠高尿酸血症病理模型
• 3.6 微囊体内活性检测
• 3.6.1 微囊灌胃体内分布
• 3.6.2 微囊体内作用效果
• 3.7 微囊冻干保护剂的考察
• 第四章 结论
• 参考文献
• 发表文章
• 致谢