论文题目: 嗜盐古生菌rad25基因上游序列在三域生物中的启动子功能研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物学
作者: 朱建裕
导师: 沈萍,胡岳华
关键词: 极端嗜盐古生菌,片段,基因,端上游序列,真细菌,真核生物,启动子活性,微量量热分析
文献来源: 中南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 利用大肠杆菌启动子探针载体pKK232-8,从极端嗜盐古生菌中基因组DNA分离得到一个能在真细菌域(大肠杆菌)中具有启动子活性的RM10 DNA片段。DNA序列查询发现它包含了嗜盐古生菌rad25基因部分编码序列和上游调控序列;DNA序列分析表明该片段既含有类似嗜盐古生菌启动子和真核生物RNA聚合酶Ⅱ启动子的TATA box特征序列等,也含有典型的真细菌启动子-35和-10区特征序列。 在嗜盐古生菌中,以β-半乳糖苷酶基因(bgaH)为报告基因,构建了RM10片段和报告基因相融合的重组质粒,通过检测报告基因转录的mRNA和表达的酶活性,证明了RM10 DNA片段的确具有启动子功能。通过构建了一系列RM10不同缺失片段融合到报告基因上游的重组质粒,检测了RM10不同缺失片段的启动子活性大小,在嗜盐古生菌中浓缩定位了RM10片段中对于启动子活性有影响的重要功能区,结果表明:rad25基因5’端上游含有TATA box和BRE特征序列(-305至-130)是片段中对启动子活性有影响的关键功能区。 在大肠杆菌中,利用氯霉素抗性基因(cat)作为报告基因,构建了RM10片段和报告基因的融合质粒,通过检测报告基因的转录和抗性水平,结果表明RM10片段在大肠杆菌具有启动子功能。通过构建缺失片段插入报告基因上游的重组质粒,在大肠杆菌对RM10片段进行了缺失突变分析,确定了rad25基因5’端上游序列包含TATAⅠ特征序列的-305～-250区段是影响RM10片段在大肠杆菌的启动子活性关键部分。结果说明rad25基因5’端上游序列在大肠杆菌有启动子功能和在嗜盐古菌中有启动子功能在序列上既存在差异,同时又是相互联系的。 在酿酒酵母菌和哺乳动物细胞中,分别利用G418抗性基因(neo~r)、绿色荧光蛋白基因(egfp)、荧光素酶基因(Luc+)为报告基因,构建各种RM10片段和报告基因相融合的重组质粒,通过检测报告基因表达的抗性水平、绿色荧光和酶活性,证实RM10在真核生物中具有启动子功能。通过构建缺失片段融合到报告基因上游的重组质粒,对RM10片段进行了缺失突变分析,结果表明:在酿酒酵母中,含有TATAⅣ和多个GGCGG box特征序列的-1767～-889区段对RM10片段在酵母菌中具有强启动子活性很重要,包含TATAⅢ特征序列的-889～-403区段是RM10片段在酵母菌中有启动子活性的基本的区段,包含TATAⅡ特征序列的-403～-329区段对RM10片段在酵母菌中有启动子活性有一定影响。在动物
论文目录:
中文摘要
英文摘要
第一章 引言
1．古生菌
1．1 古生菌的分类
1．2 古生菌的细胞学特征
1．3 古生菌的基因组
1．4 古生菌的DNA复制与修复
1．5 古生菌的转录
1．6 古生菌的DNA翻译
2．极端嗜盐古生菌
2．1 极端嗜盐古生菌概述
2．2 盐杆菌属的特点
2．3 研究极端嗜盐古生菌的生物学意义
3．古生菌基因启动子的特征
3．1 古生菌基因启动子的特征
3．2 古生菌基因启动子与其它两域生物启动子的异同
4．微量热化学技术在微生物学研究中的应用
4．1 微量热化学技术在微生物学研究中的特点
4．2 微量热化学技术在研究微生物学中应用
5．本研究的内容和意义
第二章 材料及方法
2．1 材料
2．2 方法
第三章 盐杆菌中RM10片段的序列分析和在嗜盐古菌中的启动子功能研究
3．1 结果
3．1．1 RM10片段的DNA序列测定及其结构特征分析
3．1．2 RM10片段在嗜盐古生菌中的启动子功能研究
3．2 小结与讨论
第四章 RM10在大肠杆菌中的启动子功能分析
4．1 结果
4．1．1 以cat基因为报告基因检测RM10片段在大肠杆菌中的启动子活性
4．1．2 在大肠杆菌中检测不同RM10缺失片段的启动子活性
4．2 小结与讨论
第五章 RM10片段在真核生物中的启动子功能研究
5．1 结果
5．1．1 研究RM10片段在酵母菌中的启动子功能
5．1．2 在CHO和Hela细胞中研究RM10片段的启动子功能
5．1．3 在COS细胞中利用萤光素酶做报告基因缺失分析RM10的启动子功能
5．2 小结与讨论
第六章 微量量热方法研究RM10片段在大肠杆菌中和酵母中的启动子功能
6．1 结果
6．1．1 大肠杆菌中用微量热方法研究RM10片段的启动子功能
6．1．2 在酵母菌中用微量热方法研究RM10片段的启动子功能
6．2 小结与讨论
总结
本研究工作的主要创新点
参考文献
附录
致谢
发布时间: 2006-03-28
参考文献
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