山西医科大学基础医学院
摘要：细胞工程是四大生物工程之一，在生物、医学等许多领域取得了开创性的研究成果。细胞融合方法得到不断更新，融合率也得到逐步提高。该技术在细胞遗传学、单克隆抗体及种质资源的开发利用等方面的研究具有重要意义。因此本文对细胞融合的定义机理、应用及融合技术方面的相关研究成果进行总结和阐述。
关键词：细胞融合；生物法；化学法；物理法
细胞融合技术是近30多年来迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术，已在农业、畜牧业、医药等多领域取得研究成果，且应用领域不断扩大[1]。细胞融合不仅为细胞的起源、肌肉骨骼胎盘的发育、干细胞介导的组织再生等理论领域研究提供了有力手段，而且被广泛应用于育种学、发生生物学及免疫医学，特别是在动植物新品种的培育、单克隆抗体的制备以及抗癌疫苗的研发等方面具有重要意义。
1细胞融合的定义及机理
细胞融合也称细胞杂交，是在自然条件下或用人工方法使两个或两个以上的同源或异源细胞或原生质体相互接触，发生膜融合、胞质融合和核融合而形成杂种细胞的过程。
细胞融合与病毒和细胞之间的融合有许多相似之处，即带包被的病毒或细胞通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合，过程中伴随蛋白构象的变化。细胞融合主要经过以下几个主要步骤：原生质体或细胞相互靠近；质膜融合形成细胞桥；胞质渗透；细胞核融合。其中细胞桥的形成是细胞融合的关键一步，而只有细胞核发生了融合，多核细胞才能存活下去。
2细胞融合的方法
2.1生物法
病毒诱导细胞融合：病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用而与宿主细胞膜直接融合。当其同时进入两个细胞时，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，打破两个细胞膜的隔阂，引起细胞质的交流，进而使细胞发生融合。
单纯疱疹病毒（HSV）：HSV介导细胞-细胞融合需要四种关键包膜蛋白gD，gB和异二聚体gH/gL，其介导细胞融合的过程如下：gD与细胞受体结合，导致其胞外域的C端部分发生构象变化，暴露出核心部位[2]；激活的gD与gH/gL相互作用并将其转化为正调控因子；正调控因子激活gB成为活性的融合因子[3]。最终将导致病毒和宿主细胞膜之间的融合，进而介导细胞-细胞融合。
流感病毒：流感病毒颗粒与宿主细胞表面的唾液酸结合后，通过内吞作用被内化；内含体膜中的蛋白质泵会降低含病毒体的隔室内的pH，而产生两种效果：由于质子可以通过M2离子通道进入病毒粒子内部，导致粒子内部pH降低，M1层分离，使膜更具延展性并有助于融合[4]；低pH诱导内含体中病毒糖蛋白血凝素的构象变化，导致病毒和细胞膜融合[5]，进而介导细胞-细胞融合。
信号通路介导法：研究发现MSCs和mESCs可以在共培养中自发形成融合衍生的杂合体，尽管效率较低。且Rho-Rock-actin/肌球蛋白途径不仅对MSC分化和ESC自我更新至关重要[6]，对ESC中的细胞融合也是重要的。相反，其抑制作用使MSC皮层张力减少，形成流动性更好的质膜，其促进MSC变形和ESC侵入[7]。研究已经证明不同类型的细胞，包括MSC，神经元细胞，内皮细胞和其他细胞可以通过隧道纳米管[8，9]交换囊泡和线粒体等胞质成分。
2.2化学法
化学法是指采用化学诱导剂改变细胞膜脂质分子排列诱导细胞融合的方法。
Janus粒子诱导融合：研究表明，包含氢化、氟化和混合氢化氟化JD的Janus树枝状聚合物的三组分体系通过膜水合以特定比例共组合成前所未有的超分子粒子，表示为Janus树枝状大分子。它们由哑铃形结构组成，由洋葱状氢化囊泡和洋葱状氟化囊泡系在一起。相同三组分体系的不同比例能产生各种结构，包括均匀的洋葱状囊泡、核-壳结构和完全自我分选的氢化和氟化囊泡[10]；其自分选途径可用于稳定氢化和氟化双层之间的界面。裂变样途径表明在生物系统中融合和裂变过程可能不需要蛋白质的参与，而是可以由膜组成比率的改变引起[11]。
缺氧诱导融合：研究发现缺氧促进口腔鳞癌细胞与人永生化口腔上皮细胞之间的自发性细胞融合。因为低氧可导致上皮-间质转化（EMT）[12]，其会改变上皮细胞表面的一些蛋白质，蛋白质的变化使上述两种细胞的融合率增加，而DAPT（EMT阻断剂）显著降低融合率[13]。
聚乙二醇（PEG）诱导融合：PEG促细胞融合的机制如下：PEG分子具有弱负极性，可以与具有正极性基团的水分子、蛋白质等形成氢键，在相邻的原生质体间起到分子桥的作用，使原生质体接触。当其被洗脱时，膜电荷发生紊乱而重新分配。此时，一种原生质体上带正电的基团可能与另一个原生质体中带负电的基团相连，导致原生质体融合。PEG还可以增加类脂膜的流动性，使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能，从而促进细胞融合。此外，研究发现通过调节Mg2+浓度至合适区间可以达到较高的细胞融合率，从而为PEG化学融合提供了一种优化方案[14]。
离子诱导融合法：Kuster发现机械分离的发生了质壁分离的洋葱表皮细胞原生质体在NaNO3溶液中可以恢复并伴随着细胞融合。NaNO3的钠离子可以中和原生质体表明负电荷，引起原生质体聚集，诱导细胞融合。Keller首先发现高Ca2+和高pH值可以诱发细胞融合。钙离子中和原生质体膜或细胞膜表面电荷，使彼此紧密接触；高pH能改变质膜的表面电荷，利于细胞融合。
2.3物理法
电脉冲诱导细胞融合技术：指利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿促进细胞融合的技术，是最常用的物理诱导细胞融合的方法。研究发现，电脉冲诱导的细胞融合的程度受电压力和渗透力的影响；并且渗透现象在胞吐中是重要的，因此渗透力可以为生物系统中的许多膜融合反应提供驱动力。
激光融合技术：指利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。这样由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。QuetF.Ahkong等人[15]采用激光诱导单细胞融合技术，成功制备融合肝细胞癌细胞和干细胞基因表达信息的融合细胞系。
空间细胞融合技术：由于地球引力的存在，有液泡的原生质体与无液泡的原生质体的密度差很大，异源细胞间的融合得率十分有限。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，在地面上由于无法排除地球引力的影响，要提高细胞融合得率相当困难。上世纪80年代以来，人们在空间材料科学的启发下，试图利用空间微重力条件改进细胞融合技术。大量的飞行实验结果表明，在微重力条件下酵母细胞的融合得率有很大的增加，原因主要是降低了重力沉降影响，而杂种细胞的活力增加可能是由细胞排列时间缩短引起的。
离子束细胞融合技术：离子束细胞融合技术原理如下：采用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体，通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合[16]；在离子束与细胞相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，进而实现细胞融合[17]。
非对称细胞融合技术：指利用某种外界因素辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核，并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体，选择性地使其细胞质失活。然后融合来自这两个原生质体品系的细胞，从而实现所需胞质和细胞核基因的优化组合；或使前者被打碎的细胞核染色体片段中的个别基因渗入到后者原生质体的染色体内，实现有限基因的转移，从而在保留亲本全部优良性状的同时改良其某个不良性状。
2.4物理-化学结合法
植物血凝素-ECM830细胞融合法：植物血凝素是一种有丝分裂原，可以起到细胞凝聚的作用，使得两细胞膜紧密接触。MIRui-fang等人[18]证实在植物血凝素作用的基础上进行ECM830电击融合，可以大大提高细胞融合效率。
3细胞融合的应用
3.1动物细胞融合技术的应用
用于研究细胞的核质关系、揭示疾病发生的机制、基因定位、衰老机制、动物育种、生产单克隆抗体、细胞疗法等。如以聚乙二醇作为介导，将小白鼠骨髓的瘤细胞和进行绵羊红细胞免疫处理的小白鼠B淋巴细胞进行细胞融合，从而形成单克隆抗体技术[19]。
3.2植物细胞融合技术的应用
改善作物品质、培育抗逆植株、种质保存和有用物质生产、无性系的快速繁殖和植物疾病防治等。如用细胞融合技术将球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌进行融合，培养出具有灭蚊和灭螟能力的新菌株[19]。
3.3微生物细胞融合技术的应用
用于生物药品的生产，包括抗生素、生物活性物质、疫苗等；如细胞融合棘孢小单孢菌和灰色链霉菌素，相比于亲本菌，融合子产庆大霉素的产量明显得到提高[19]。还为发酵工业提供优良菌种，如酿酒酵母和糖化酵母的种间杂交，分离子后代中个别菌株具有糖化和发酵的双重能力。
结语
细胞融合技术在生物、医药等多个领域有巨大的潜在应用价值，其发展前景非常广阔。因此，来自物理、生物、医学等领域的各国科学家相继在该领域倾注了大量人力物力进行专项研究。毫无疑问，它将成为21世纪的新兴产业，定能为人类带来福音。
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