论文摘要
研究背景和目的动物实验和临床病人的研究资料均表明，急性脑缺血能诱导缺血区及其周围区血管保护性增生，新生血管能够增加缺血半暗区氧气和营养物质的供应，从而促进神经功能的恢复；然而，脑缺血后自体内源性促血管增殖因子表达量往往不足以诱导有效的代偿性微循环重建。因此，应用外源性促血管生成因子促进微血管增生治疗脑缺血的实验研究在近年来逐渐成为了研究热点之一。其中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）是目前发现的最强的，也是在脑缺血实验中应用最多的促血管生成因子。大量研究表明，在急性脑缺血后VEGF在脑内有广泛的表达，在中枢神经系统VEGF不仅具有促进血管内皮细胞增殖和促进新生血管形成的作用，而且还具有直接的神经营养、神经保护以及抗神经细胞和神经前体细胞凋亡等多种作用，是治疗脑缺血等缺血性疾病颇具前景的细胞因子。另外，急性脑缺血的治疗有严格的时间窗，治疗因子早期干预治疗以挽救缺血半暗带受损细胞是基本治疗原则之一。然而，不少研究明确表明，VEGF在急性脑缺血的早期血管内应用可以增加血脑屏障（blood brain barrier，BBB）的破坏，增加微血管的渗出，诱发严重的脑水肿，甚至形成缺血灶内血肿。近年来，为了在脑缺血早期发挥VEGF最大限度的治疗作用，避免其作为通透性因子诱发脑水肿的副作用，很多学者相继做了不少有益的探索研究。这些研究主要集中在以下两个方面：（1）改良VEGF的用药途径：很多研究表明，在脑缺血早期通过脑室途径应用VEGF能够充分发挥其治疗保护作用，同时避免了其诱发BBB破坏和脑水肿的副作用。这些研究结果证实治疗途径对于VEGF在脑缺血的早期的成功应用可能是至关重要的，脑室途径可能因为VEGF不直接接触作用于血管内皮细胞从而减轻或者避免了诱发微血管的通透性增高；（2）VEGF和血管生成素（Angiopoietin-1，Ang1）联合应用：近年来很多研究还表明，Ang-1参与维持成熟血管的完整性，它的表达可抑制单层血管内皮细胞的通透性，防止微血管渗漏，是迄今为止发现的第一个作用于血管内皮细胞的抗血管通透性因子，这提示Ang-1在调节血管通透性方面发挥重要作用。也有很多研究也证明，Ang-1可以对抗由VEGF所引发的血管渗透性增加，并认为Ang-1和VEGF的平衡对于维持中枢神经系统BBB的完整性起关键作用，而在急性脑缺血打破了这种平衡从而诱发了BBB的破坏。研究内容、方法及结果尽管上述最新的研究成果证实了早期脑室途径应用VEGF或者VEGF和Ang-1联合应用在脑缺血的治疗中取得了较好的疗效。但是VEGF和Ang-1都是大分子蛋白质，无论通过何种用药途径恐怕很难透过BBB进入脑实质内发挥其药理作用。也有研究指出通过脑室内输注，由于BBB的限制，大分子量的治疗因子只是局限分布在脑室室管膜表层和脑脊液内，其分布体积不足脑体积的1％。相比之下，脑室途径应用病毒载体介导的VEGF或Ang-1基因转染可能是更好的治疗途径，因为病毒载体比大分子治疗因子具有更强的通过BBB和脑室壁的能力。而且我们实验室的前期工作已经证实成年大鼠侧脑室内输注携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）报告基因的rAAV1型载体能够实现EGFP在大脑皮层、胼胝体和纹状体等较广泛脑区的转染和基因表达。本研究将采用脑立体定向输注的方法，将rAAV1-VEGF治疗载体或者rAAV1-VEGF和rAAV1-Angl的混合治疗载体通过侧脑室转染途径对大鼠大脑中动脉阻塞缺血再灌注模型（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）进行基因治疗，以观察其在脑缺血再灌注损伤中的治疗作用和可能的机制。本研究共分两部分：（1）rAAV1-VEGF165单基因治疗大鼠脑缺血疗效及其机制的实验研究。在该研究中我们系统的检测了rAAV1-VEGF165脑室途径转染后在脑内的表达和脑微血管增殖的情况，并在缺血早期不同时问点对脑水含量、颅内压、脑水肿体积、脑梗塞体积和神经功能评分等项目进行了系统的检测。我们的结果表明在大鼠tMCAO脑缺血再灌注损伤前8周，通过脑室途径注入治疗载体rAAV-VEGF165基因治疗可以使VEGF165在脑内得到较高水平的表达，并可以促进脑内微血管密度的增加，但VEGF165的过度表达在脑缺血早期会诱发缺血半球脑水含量显著增加、脑水肿体积增大，从而引起颅内压显著性增高，进而加重了缺血后的继发性脑损伤，导致了脑梗死体积的扩展和神经功能评分的增加。上述结果可能与VEGF在脑缺血早期增加微血管和BBB的通透性密切相关。（2）rAAV1-VEGF165联合rAAV1-Ang1基因治疗大鼠脑缺血疗效及机制的实验研究。在该研究中我们系统的检测了rAAV1-VEGF165和rAAV1-Ang1经脑室途径混合转染后在脑内的表达情况，并对大鼠脑缺血再灌注损伤后的BBB的通透性、缺血周围区微血管的密度、缺血周围区脑血流量、细胞调亡及BBB功能性蛋白因子表达等项目进行了系统的检测，我们的研究结果初步表明，通过脑室途径在大鼠tMCAO脑缺血再灌注损伤前8周，利用rAAV-VEGF165联合rAAV-Ang1双基因治疗与rAAV-VEGF165单基因治疗相比，可以明显减轻脑缺血后BBB渗出，促进缺血灶周围区血管密度的显著增加及增加其脑血流量，增加脑保护蛋白c-fos的生成表达，减少了缺血性细胞的调亡，减少与脑水肿密切相关的4型水通道蛋白的表达。上述治疗机制可能与rAAV-Ang1协同VEGF促使具有occludin蛋白表达的在功能上更加成熟的新生微血管增殖有关。结论在脑缺血早期应用VEGF可以明显增加缺血脑组织BBB的渗出，诱发脑水肿，从而引起颅内压明显增高，加重了继发性脑损伤，故应该避免VEGF在脑缺血急性期的应用。脑室途径应用VEGF并不能避免其在脑内增加微血管渗出的副作用。通过脑室途径，rAAV载体介导的VEGF和Ang1双基因联合治疗脑缺血是很有前景的治疗方法，该方法一方面可以成功的实现治疗基因在脑内的广泛转染，另一方面外源性表达的VEGF和Ang1在脑缺血急性期能够协同促进有功能的微血管增生，抑制BBB渗出，协同发挥神经保护作用。
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