论文摘要
前言肿瘤的生长和转移都是血管依赖性的，新生血管的生成不仅为肿瘤的生长提供营养，同时也为肿瘤的扩散和转移提供了可能。研究表明高血管密度是乳腺癌的高危因子之一，新生血管的形成直接和乳腺癌的恶性程度及预后有关，因此，抗肿瘤血管生成已成为近年乳腺癌治疗研究的热点。血管抑素作为肿瘤血管生长的抑制因子，在体外它可以抑制正常血管内皮细胞的增殖和迁移，诱导细胞周期的捕获和凋亡，且减少内皮细胞的侵袭和血管的形成；而在体内可以抑制多种原发瘤和转移瘤的生长。如果它可以抑制乳腺癌的生长，那么血管抑素的抗肿瘤血管生成治疗将有望成为乳腺癌治疗的新途径。目的探讨血管抑素（angiostatin）的基因导入对乳腺癌的血管生成及乳腺癌生长抑制的作用。方法1、细胞培养：SD鼠的乳腺肿瘤细胞SHZ88细胞，于含10％小牛血清100IU／ml青霉素和100ug／ml的链霉素的RPMI1640培养基中进行，培养条件为37℃、5％CO2，实验采用对数期生长的细胞，调整浓度为5×106个细胞／100ul生理盐水，用于建立动物模型。2、动物模型的建立：出生3-4天的SD鼠共30只，每只SD鼠颈部取一点皮下注射细胞悬液100ul。当肿瘤细胞注射一周后，即鼠体内的肿瘤大约长至0.4cm时，将荷瘤的SD鼠随机分成两个实验组，分别为血管抑素基因导入组和空白对照组，每组15只。3、血管抑素的基因导入和体内实验：通过重组的腺相关病毒载体将血管抑素导入体内。血管抑素基因导入组，在肿瘤细胞注射后的第7、14、21、28天各进行一次重组有血管抑素基因的重组腺相关病毒载体（AAV-ANG）的肿瘤内注射，每次注射的剂量为2×109pfu；空白对照组，肿瘤内每次只注射100ul生理盐水。4、测量肿瘤的体积、绘制肿瘤的生长曲线：动物模型建立后，每天监测肿瘤的生长情况和SD大鼠的生存情况，每周用游标卡尺测量一次肿瘤的最长、最短径，计算肿瘤的体积及生长抑制率，绘制皮下肿瘤体积一时间生长曲线。5、病理组织学检查：处死SD鼠，观察移植瘤的形态。取肿瘤组织固定于福尔马林溶液中，石蜡包埋，组织切片，常规HE染色，组织病理检查。6、CD34免疫组化染色：运用SABC法，通过抗CD34的兔抗大鼠抗体对肿瘤组织中的血管内皮细胞进行染色。7、微血管密度的检测：通过显微图象分析系统对微血管密度进行分析。8、肿瘤内AAV-ANG导入的检测：运用SP法通过抗AAV-ANG的小鼠抗大鼠的抗体对肿瘤内导入的AAV-ANG进行检测。9、统计学处理：用SPSS软件对数据进行分析，数据差异显著性检验采用Students′T检验，以P＜0.05为差异有显著意义。结果1、血管抑素的基因导入对鼠体内乳腺移植瘤的生长有明显的抑制作用（t=10.31，P＜0.01），并且随着注射次数的增加，血管抑素对肿瘤的抑制率也增加。此外，实验中还观察到空白对照组带瘤生存的时间为36天，而血管抑素基因导入组带瘤生存时间为56天，腺相关病毒载体介导的血管抑素基因导入可能延长鼠带瘤生存的时间。2、病理学特征：在SD鼠接种的5天左右颈部可见到肿块，且肿瘤随时间的增加而增大。处死SD鼠，取出肿瘤组织，肉眼可见血管抑素基因导入组的肿瘤组织呈苍白色，与皮肤不粘连，切面可见坏死现象，而空白对照组的肿瘤组织呈鲜红色，与皮肤有部分粘连，切面可见大量的出血。光镜下特点：HE染色所示，血管抑素基因导入组可见大量的组织坏死，其周围瘤细胞核固缩并崩解，因此随处可见细胞核碎片。空白对照组的核染色质多呈粗块状，核分裂相多见，异质性非常明显，并多处可见粉红色的微血管。3、用CD34抗体对肿瘤标本进行免疫组化染色，在显微镜下可以看到肿瘤组织的血管内皮细胞被染成褐色。显微图象分析系统显示，血管抑素基因导入组（96.8±69.2／mm2）和空白对照组（475.6±163.2／mm2）的微血管密度有显著差异（t’=-9.935 p＜0.001）。4、用AAV-ANG抗体对肿瘤组织进行免疫组化染色可以看到血管抑素基因导入组的组织切片中有被染成褐色的AAN-ANG，而空白对照组的组织切片未见。结论血管抑素的基因导入可以抑制乳腺癌新生血管的生成，进而抑制乳腺癌的生长。