双重靶效应基因嵌合重组体的构建与表达

论文摘要

研究发现基质细胞衍生因子（Stromal cell-derived factor-1,SDF-1）及其受体CXCR4（CXC chemokine receptor-4）是决定乳腺癌转移的关键因子。我们对SDF-1进行多位点定向遗传改造,从中筛选出能与CXCR4高特异性结合,但不能激活CXCR4耦联的G 蛋白下游信号通路的拮抗剂。此拮抗剂通过竞争性地阻碍野生型SDF-1与CXCR4 的结合,破坏乳腺癌原发灶与远程特定转移器官之间所存在的SDF-1 梯度,切断乳腺癌转移的潜在通路,从而抑制乳腺癌的转移。近年来,小分子富含亮氨酸蛋白糖甙家族成员---饰胶蛋白（Decorin）因被证实是一强的肿瘤细胞生长负性调节因子而成为肿瘤研究领域的热点。研究表明Decorin 通过特异性阻断表皮生长因子受体-2（HER-2）高表达而抑制癌细胞浸润性生长。本研究的主要目的是将SDF-1 的突变体通过人类IgG1 抗体重链的铰链区（IgG1 Heavy Chain Hinge Region,以下简称Hinge）与Decorin 连接而构建双重靶效应基因嵌合重组体,以抑制乳腺癌的生长和转移。一共构建了三种嵌合基因SDF-1p2g-Hinge-Decorin（以下简称p2gch）,SDF-1p2g54-Hinge-Decorin（以下简称p2g54ch）和SDF-wt-Gly×4-Decorin（以下简称wtch）。p2gch 的构建方法为:以本室构建的野生型hSDF-1 基因为摸板,采用PCR 定点突变的方法,将SDF-1 的N 端第二个氨基酸Pro 突变为Gly,所形成的突变体SDF-1p2g 再通过人工合成的Hinge 与采用RT-PCR 法从人骨髓中克隆的Decorin 成熟肽编码序列相连,即得到嵌合基因p2gch。p2g54ch 是在构建p2gch的基础上采用PCR 的方法进一步使SDF-1 C 端α-螺旋缺失而形成的嵌合基因p2g54ch。由于后来发现这两种嵌合基因所表达的蛋白P2Gch 和P2G54ch 不够稳定,有分解现象,遂决定将SDF-1 与Decorin 之间的连接片断Hinge 替换为结构更简单的四个甘氨酸（Gly-Gly-Gly-Gly）短肽,因而构建了第三种嵌合体wtch,其构建方法为:通过引物设计将Gly×4 直接连在野生型SDF-1 基因（SDF-wt）的3-端,然后Gly×4 再与PCR 得到的Decorin 连接即得到嵌合基因wtch。将构建好的嵌合基因插入原核表达载体pET-30a（+）,转入大肠杆菌BL21（DE3）,用IPTG 诱导表达。由于突变型嵌合蛋白P2Gch 和P2G54ch 在N 端带有载体表达的6×His 标签,野生型嵌合蛋白WTch 在C 端带有载体表达的6×His 标签,因此三种嵌合蛋白均可在变性条件下用镍柱亲和层析进行纯化。纯化产物用稀释、透析和超滤法进行复性,复性的蛋白用MTT 法初步检测其活性。基因测序结果表明三种嵌合体构建完全正确,SDS-PAGE 检测结果表明三种嵌

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词表
• 目录
• 1 绪论
• 1.1 研究背景及项目的提出
• 1.2 嵌合重组体原核表达载体的构建方案
• 1.3 具体技术路线
• 2 双重靶效应的基因嵌合重组体的克隆
• 2.1 引言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 SDF-1p29,SDF-1p2954 和SDF-1wt 成熟肽编码序列的扩增
• 2.3.2 重组质粒SDF-1p2g /pMD18-T、SDF-1p2g54/pMD18-T 和 SDF-1wt/ pMD18-T 的酶切结果
• 2.3.3 SDF-1p2g-Hinge/pMD18-T 阳性克隆的筛选及鉴定
• 2.3.4 Decorin 的PCR 扩增
• 2.3.5 Decorin/pMD18-T 重组体酶切结果
• 2.3.6 PCR 鉴定p2gch/pMD18-T 嵌合重组体
• 2.3.7 p2gch/pET-30a（+）重组体的酶切鉴定
• 2.3.8 p2g54ch/pET-30a（+）重组体的酶切鉴定
• 2.3.9 SDF-1wt/pET-30a（+）阳性克隆的筛选及鉴定
• 2.3.10 PCR 法鉴定wtch/pET-30a（+）
• 3 双重靶效应的基因嵌合重组体的表达、纯化和鉴定
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 基因嵌合重组体p29ch、p2954ch 和wtch 在BL21（DE3）中的表达
• 3.3.2 His-tag /P2Gch、His-tag /P2G54ch 和 WTch/ His-tag 嵌合重组体蛋白的 ProBond Resin 镍固相亲和层析
• 3.3.3 Western-blotting 结果
• 4 嵌合蛋白 P2Gch、P2G54ch 和 WTch 的复性
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 嵌合蛋白P2Gch、P2G54ch 和WTch 的复性
• 4.3.2 嵌合体目标蛋白的浓度测定
• 5 嵌合蛋白活性的初步鉴定
• 5.1 前言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 方法
• 5.3 MTT 实验结果
• 6 讨论
• 6.1 SDF-1/Decorin 嵌合重组体的体外表达
• 6.2 SDF-1/Decorin 嵌合蛋白的稳定性
• 6.3 SDF-1/Decorin 嵌合重组体在大肠杆菌中表达产物的复性
• 6.4 SDF-1/Decorin 嵌合重组体的潜在用途
• 7 结论、创新性与展望
• 7.1 结论
• 7.2 本项目的创新之处
• 7.3 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 附录 1 攻读硕士学位期间论文发表情况
• 附录 2 攻读硕士学位期间科研成果
• 附录 3 攻读硕士学位期间参加科研项目