棉铃虫N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质研究

论文题目: 棉铃虫N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及性质研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 农药学

作者: 黄小红

导师: 关雄,陈清西

关键词: 棉铃虫,乙酰氨基葡萄糖苷酶,金属离子,有机溶剂,酶促动力学

文献来源: 福建农林大学

发表年度: 2005

论文摘要: 以棉铃虫的蛹为材料,通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-200分子筛柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化,获得聚丙烯酰胺凝胶电泳单一纯的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶（NAGase,EC3.2.1.52）制剂。纯酶的比活力为2678.79 U/mg。酶催化对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖水解的最适pH为5.63,最适温度为55℃。该酶在pH 4～8区域较稳定,而在pH>8能迅速失活;酶促反应符合米氏方程,Km为0.1629 mmol/L,Vm为10.73μmol/L/min,活化能为66.24 kJ/mol。酶分子的分子量为89.3 kD。 研究金属离子对棉铃虫NAGase活力的影响。结果表明,Na+、K+和Li+等金属离子对酶活力没有任何影响。Mg2+、Ca2+、Co2+对酶活力影响不显著,Zn2+、Cu2+、Cd2+、Al3+、Hg2+和Pb2+对该酶有不同程度的抑制作用。研究Cu2+、Al3+、Zn2+、Hg2+和Pb2+的抑制作用动力学,结果表明:这些金属离子对酶均表现为可逆抑制作用,Cu2+的抑制类型为混合型,抑制常数K1为0.23 mmol/L,KIS为1.49 mmol/L。Al3+为竞争性类型,抑制常数K1为6.42mmol/L。Hg2+为混合型,抑制常数K1为28.43μmol/L,KIS为2.25μmol/L mmol/L。Pb2+为非竞争性抑制,抑制常数KIS为0.3208mmol/L。Zn2+为竞争性类型,抑制常数KI为1.158 mmol/L。Zn2+对酶的pH稳定性的影响不明显,而有Zn2+存在时,在30-40℃范围内,酶是稳定的,温度高于50℃后,随着Zn2+浓度的增加,酶的热失活程度可以缓解。 用金属螯合剂（EDTA）处理棉铃虫NAGase后可使酶活力完全丧失,说明该酶活力的发挥与某些的金属离子有关。 研究几种有机溶剂对棉铃虫NAGase的活力与构象的影响。结果表明:甲醇、乙醇和乙二醇对酶有先扬后抑作用,正丙醇和丙三醇对酶有失活作用。多元醇中的乙二醇对酶的效应是先扬后抑,丙三醇不同的浓度均可使酶活力下降,两者相比,丙三醇对酶的失活作用略比乙二醇的强。甲醛对酶的活性有抑制作用,是一种可逆混合型抑制作用。抑制常数KI与KIS分别为

论文目录:

中文摘要

英文摘要

1 前言

1.1 棉铃虫研究概况

1.2 几丁质

1.3 几丁质酶和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶

1.3.1 酶的概况

1.3.2 研究历史

1.3.3 化性质

1.3.4 生化性质

1.3.5 生理功能

1.3.6 酶的杀虫增效作用

1.3.7 防治真菌病害研究

1.3.8 酶在医学上的应用

1.4 本研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 仪器

2.2 材料与试剂

2.3 方法

2.3.1 蛋白质浓度测定

2.3.2 酶活力和比活力的测定

2.3.3 试剂处理

2.3.4 酶的分离纯化

2.3.4.1 幼虫和成虫酶的提取

2.3.4.2 蛹N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化

2.3.4.3 酶的纯度鉴定

2.3.5 酶的理化性质测定

2.3.5.1 酶的分子量测定

2.3.5.2 酶分子的紫外吸收光谱测定

2.3.5.3 酶分子的内源荧光光谱测定

2.3.6 酶催化反应的动力学性质研究

2.3.6.1 温度对酶活力的影响

2.3.6.2 酶的热稳定性

2.3.6.3 pH对酶活力的影响

2.3.6.4 酶的酸碱稳定性

2.3.6.5 酶催化pNP-β-D-GlcNAc水解的动力学参数测定

2.3.6.6 酶催化底物pNP-β-D-GlcNAc水解反应的活化能测定

2.3.7 金属离子对酶活力的影响

2.3.7.1 正一价碱金属离子对酶的效应

2.3.7.2 二价金属离子对棉铃虫NAGase活力的影响

2.3.7.3 Al~(3+)对棉铃虫NAGase的影响

2.3.7.4 Cu~(2+)对棉铃虫NAGase抑制效应及抑制常数的测定

2.3.7.5 重金属离子对酶活力的影响

2.3.7.6 金属离子对酶的作用动力学

2.3.7.7 Zn~(2+)对酶的效应

2.3.8 EDTA对酶活力的影响

2.3.9 有机溶剂对酶活力的影响

2.3.10 糖对棉铃虫NAGase活力的影响

2.3.11 变性剂对棉铃虫NAGase活力的影响

2.3.12 PCMB对棉铃虫NAGase的影响

2.3.13 NBS对棉铃虫NAGase的影响

2.3.14 酶的热失活动力学研究方法

2.3.14.1 酶的热失活动力学

2.3.14.2 酶的热变性后紫外光谱的变化

2.3.14.3 酶的热变性后荧光发射光谱的变化

3 结果与分析

3.1 酶的分离、纯化及纯度鉴定

3.1.1 棉铃虫蛹的NAGase的分离纯化

3.1.2 酶的纯度鉴定

3.1.3 幼虫和成虫酶的粗酶的制备

3.2 酶的理化性质

3.2.1 酶的分子量测定

3.2.2 酶分子的紫外吸收光谱测定

3.2.3 酶分子的内源荧光光谱测定

3.3 酶催化反应的动力学性质研究

3.3.1 温度对酶活力的影响

3.3.2 酶的热稳定性

3.3.3 pH对酶活力的影响

3.3.4 酶的酸碱稳定性

3.3.5 不同虫态的酶催化pNF-β-D-GlcNAc水解的动力学参数测定

3.3.6 酶催化底物pNP-β-D-GlcNAc水解反应的活化能测定

3.4 金属离子对棉铃虫蛹NAGase的影响

3.4.1 正一价碱金属离子对棉铃虫NAGase活力的影响

3.4.2 正二价碱土金属离子对棉铃虫NAGase活力的影响

3.4.3 Cu~(2+)对棉铃虫NAGase活力的影响

3.4.4 Cu~2对棉铃虫NAGase的抑制表现为可逆效应

3.4.5 Cu~(2+)对棉铃虫NAGase抑制效应及抑制常数的测定

3.4.6 Al~(3+)对棉铃虫NAGase的效应

3.4.7 Al~(3+)对棉铃虫NAGase的抑制表现为可逆抑制

3.4.8 Al~(3+)对棉铃虫NAGase抑制机理及抑制常数的测定

3.4.9 Zn~(2+)对酶的效应

3.4.9.1 Zn~(2+)离子对棉铃虫NAGase活力的影响

3.4.9.2 Zn~(2+)对棉铃虫NAGase的抑制表现为可逆效应

3.4.9.3 Zn~(2+)对棉铃虫NAGase抑制机理及抑制常数的测定

3.4.9.4 Zn~(2+)对酶的pH稳定性的影响

3.4.9.5 Zn~(2+)对酶的温度稳定性的影响

3.4.10 重金属离子对酶活力的影响

3.4.10.1 Hg~(2+)对酶活力的影响

3.4.10.2 Hg~(2+)对棉铃虫NAGase的抑制表现为可逆效应

3.4.10.3 Hg~(2+)对棉铃虫NAGase抑制机理及抑制常数的测定

3.4.10.4 pb~(2+)对酶活力的影响

3.4.10.5 pb~(2+)对棉铃虫NAGase的抑制表现为可逆效应

3.4.10.6 pb~(2+)对棉铃虫NAGase抑制机理及抑制常数的测定

3.5 EDTA对不同虫态的酶活力的影响

3.6 有机溶剂对棉铃虫蛹NAGase的影响

3.6.1 几种伯醇对棉铃虫NAGase活力的影响

3.6.2 多元醇对棉铃虫NAGase活力的影响

3.6.3 甲醛对棉铃虫NAGase的影响

3.6.3.1 甲醛对棉铃虫NAGase活力的影响

3.6.3.2 甲醛对棉铃虫NAGase抑制效应测定

3.6.3.3 甲醛对棉铃虫NAGase抑制常数的测定

3.6.4 丙酮对棉铃虫蛹NAGase的影响

3.6.4.1 丙酮对棉铃虫NAGase活力的影响

3.6.4.2 丙酮对棉铃虫NAGase抑制作用机理的判断

3.6.4.3 丙酮对棉铃虫NAGase抑制类型的判断

3.6.4.4 丙酮对酶分子构象的微扰作用

3.6.5 二甲亚砜和二氧六环对棉铃虫NAGase的影响

3.6.5.1 二甲亚砜对棉铃虫NAGase活力的影响

3.6.5.2 二甲亚砜对棉铃虫NAGase抑制作用机理的判断

3.6.5.3 二甲亚砜对棉铃虫NAGase抑制类型的判断

3.6.5.4 酶经二甲亚砜微扰后的荧光发射光谱的变化

3.6.5.5 酶经二甲亚砜微扰后的紫外光谱的变化

3.6.5.6 二氧六环对棉铃虫NAGase活力的影响

3.6.5.7 二氧六环对棉铃虫NAGase抑制作用机理的判断

3.6.5.8 二氧六环对棉铃虫NAGase抑制类型的判断

3.6.5.9 酶经二氧六环微扰后的荧光发射光谱的变化

3.6.5.10 酶经二氧六环微扰后的紫外光谱的变化

3.7 糖对棉铃虫NAGase活力的影响

3.7.1 蔗糖对棉铃虫NAGase活力的影响

3.7.2 葡萄糖对棉铃虫不同虫态的NAGase活力的影响

3.8 变性剂对棉铃虫NAGase活力的影响

3.8.1 H_2O_2对棉铃虫不同虫态的NAGase活力的影响

3.8.2 SDS对棉铃虫不同虫态NAGase活力的影响

3.8.3 盐酸胍和脲对棉铃虫NAGase活力的影响

3.8.4 酶经盐酸胍作用后的荧光光谱变化

3.9 PCMB对棉铃虫NAGase的影响

3.10 NBS对棉铃虫NAGase的影响

3.10.1 NBS对棉铃虫NAGase活力的影响

3.10.2 酶经NBS作用后的光谱变化

3.11 酶的热失活动力学

3.11.1 NAGase热失活的动力学模型建立

3.11.2 底物对棉铃虫NAGase热失活的影响

3.11.3 酶的热变性后内源荧光发射光谱的变化

3.11.4 酶的热变性后紫外吸收光谱的变化

4 讨论

4.1 酶的分离纯化与理化性质

4.2 金属离子和EDTA对棉铃虫NAGase的影响

4.3 有机溶剂对棉铃虫NAGase的影响

4.4 变性剂对棉铃虫NAGase的影响

4.5 PCMB和NBS对棉铃虫NAGase的影响

4.6 棉铃虫NAGase在热变性过程中活力与构象变化研究

5 结论

6 参考文献

7 发表论文和待发表论文

8 致谢

发布时间: 2005-09-27

参考文献

• [1].植物免疫受体激酶作用机理研究[D]. 刘自旭.南京大学2013
• [2].几丁质合成与水解酶的抑制剂及抑制机理[D]. 陈琦.大连理工大学2017
• [3].高效灭蝗基因工程菌的构建[D]. 张杰.四川大学2004
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• [8].Bt cry基因克隆和环状芽孢杆菌几丁质酶的研究[D]. 檀建新.中国农业科学院2000
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