葛内生真菌次生代谢产物清除自由基活性的研究

论文摘要

本文采用DPPH自由基酶标仪检测方法对葛内生真菌（endophytic fungnnus）次生代谢产物进行了清除自由基活性的筛选。发现一株采集于安徽宣城马姑山的野葛叶中分离出的菌株10y-4具有较强的清除自由基活性,并以该菌株次生代谢产物的自由基清除率为指标,进行了培养条件和活性物质提取工艺的研究。具体主要内容包括:葛内生真菌的采集、培养与分离,活性菌株的筛选,营养性因素和非营养性因素对10y-4菌株次生代谢产物清除自由基活性影响的研究,活性组分的分离提取工艺和分离纯化,活性化合物的纯度鉴定与分析。药用植物葛采集于安徽黄山、宣城、泾县和合肥,从葛的根、茎、叶以及果实中共分离出128株内生真菌,其中从叶中分离出49株（占总分离菌株的38.3%）,从茎中分离出35株（占总分离菌株的27.3%）,根中分离出40株（占总分离菌株的31.3%）,果实中分离出4株（占总分离菌株的3.1%）。采用酶标仪法对128株内生真菌的液体发酵培养物进行了初筛,其中菌株HK-19（茎,宣城）、HK-53（叶,黄山）、HK-96（叶,合肥）、4g-6（根,黄山）、10y-4（叶,宣城）自由基清除率都在70%以上,对这些活性较高的菌株进行复筛,结果发现菌株10y-4的活性最高,在浓度2.5mg/ml反应时间为20min时,其自由基清除率达到92.3%。通过液体培养基组成成分的正交试验,以自由基清除率为指标,比较不同的营养性因素包括碳氮源、无机盐及不同的非营养因素包括pH、温度和培养时间对清除自由基活性的影响。试验结果表明:菌株10y-4的最佳碳源是葡萄糖和麦芽糖组成的复合碳源,该复合碳源对菌株的清除自由基活性具有明显的促进作用,菌株10y-4的最佳氮源为蚕蛹粉。结合无机盐和生长因子的影响,最终得到最适液体培养基的组成为:即葡萄糖10g·L-1、麦芽糖10 g·L-1、蚕蛹粉20 g·L-1、MgSO4·7H2O0.4 g·L-1、柠檬酸铵0.4 g·L-1、VB 0.2 g·L-1。试验研究了非营养性因素中的pH值、接种量、发酵温度和培养时间对菌株10y-4清除自由基活性的影响,结果表明:100ml摇瓶中装40ml液体培养基,在pH值为6.5,接种量为5%,生长温度为25℃,培养时间为10d时有利于清除自由基活性的提高。在原始培养基的基础上添加了葛根煎汁培养液,结果发现在相同的情况下可以促进内生真菌的产生,提高内生真菌的分离效率。通过比较不同提取方法的处理及相关理化试验,确立了活性物质的最佳提取工艺为:发酵液50℃浓缩至原体积的1/5,加入3倍体积95%乙醇（乙醇终浓度为75%）醇沉两次,弃沉淀并脱醇后,以正丁醇为萃取试剂,按2:1的体积比分三次萃取,取正丁醇相,浓缩至干,即得到活性物质的粗提品。本试验采用高效液相色谱法分析粗提物,同时收集流分进行活性测定,进而确定活性组分的大致部位,再经高效液相制备柱多次制备及合并组分最终获得了一个化合物G-1,运用高效液相法（HPLC）和薄层层析法（TLC）对该化合物进行纯度鉴定并分析。高分辨质谱和紫外光谱分析及数据库检索发现该化合物是3-（2,4-二羟戊基）-6,8-二羟异香豆素,分子量为280,分子式为C14H16O6,为黄色粉末状。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 植物内生真菌的研究概况
• 1.2 自由基的研究概况
• 1.3 自由基清除剂研究状况
• 1.4 微生物药物的研究进展
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 4 结果与分析
• 4.1 内生真菌的分离结果
• 4.2 清除自由基活性菌株的筛选
• 4.2.1 活性菌株的初筛
• 4.2.2 活性菌株的复筛
• 4.3 液体培养条件的优化
• 4.3.1 营养性因素对10y-4菌株清除自由基活性的影响
• 4.3.2 非营养性因素对10y-4菌株清除自由基活性的影响
• 4.4 清除自由基活性物质的提取工艺
• 4.4.1 菌丝体的去除
• 4.4.2 大分子杂质的去除
• 4.4.3 最佳浓缩温度的确定
• 4.4.4 最佳萃取试剂的选择
• 4.4.5 最佳萃取体积比的确定
• 4.4.6 最佳萃取次数的确定
• 4.5 活性物质的分离与纯化
• 4.5.1 活性组分的初步分离
• 4.5.2 活性组分的进一步分离
• 4.5.3 活性指导下的制备
• 4.6 活性组分的纯度鉴定
• 4.6.1 高效液相色谱（HPLC）分析进行纯度鉴定
• 4.6.2 薄层层析（TLC）法进行纯度鉴定
• 4.6.3 活性化合物的分析
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士期间发表的学术论文目录