滞育诱导温度和光照节律对家蚕滞育相关内分泌基因表达的影响

论文摘要

家蚕（Bombyx mori）是卵滞育性鳞翅目模式昆虫。滞育受亲代卵催青期温度、光照节律等环境因子诱导,并受产下后温度诱导决定表现。本文以经典的家蚕滞育卵诱导条件处理家蚕催青期蚕卵,调查家蚕促前胸腺激素基因Ptth、滞育激素—性信息素合成激活肽基因Dh-pban、羽化激素基因Eh以及垂体同源框激素基因Pitx的表达谱。主要获得了以下结果:1家蚕4个滞育相关内分泌基因的表达存在显著的组织差异性家蚕大造品种5龄幼虫期基因芯片表达谱显示,Ptth、Dh-pban、Eh以及Pitx 4个基因在家蚕头部等10个组织中的表达水平有显著差异,具有组织特异性,Ptth基因在家蚕头部表达水平最高,其它组织中几乎不表达;Dh-pban基因在家蚕头部表达水平最高,其次是后部丝腺和马氏管,其他组织中表达量很低;Eh基因在体壁的表达水平最高,其次是头部,在卵巢中几乎检测不到;Pitx基因在马氏管中表达水平最高,其次是中肠和头部,其他组织中表达水平较低,其中在血液中仅痕迹量表达。Eh和Pitx基因在不同组织中的表达有极显著的差异性。值得注意的是,卵巢这一蚕卵形成和滞育代谢的重要靶器官中,5龄幼虫期Ptth、Dh-pban、Eh以及Pitx 4个基因的表达水平都很低, Eh基因几乎检测不到有表达。2诱导子代滞育卵发生的高温与光照条件上调家蚕Dh-pban基因表达催青期在诱导子代滞育卵发生的高温25℃与持续光照（25LL）条件下,胚胎有稳定的、高水平Dh-pban基因mRNA存在,而诱导子代非滞育卵发生的低温15℃与持续黑暗（15DD）条件下,蚕卵中几乎检测不到Dh-pban基因的mRNA存在。在25LL或者20℃12h光照12h黑暗（20LD）催青环境中,胚胎发育至单眼形成后（积温高于2160℃·h）,蚕卵中的Dh-pban基因表达水平开始显著上调,这与在此阶段的蚕卵胚胎对滞育诱导环境温度和光节律更加敏感相一致,但Dh-pban基因表达水平没有出现随不同滞育诱导温度或光节律变化的振荡节律,表明蚕卵胚胎的Dh-pban基因表达受到滞育诱导温度和光照这两个近日节律授时因子的影响,但不是节律授时因子直接调控的基因。从催青期开始的整个世代保护温度和光照,对家蚕胚后幼虫至成虫时期Dh-pban基因的表达水平影响,呈现高温25℃上调Dh-pban基因的表达。亲代卵孵化期的催青温度与光照,影响了子代卵的滞育性,也影响了子代卵内的Dh-pban基因mRNA水平,但这种影响与蚕卵的滞育性不完全一致。3光照与温度对家蚕Eh和Pitx基因在各个时期表达的影响不同15DD条件下,蚕卵Eh基因的mRNA水平很低,提示在非滞育卵完全诱发条件下,蚕卵胚胎可能极少翻译EH;催青期在25LL或20LD环境下,能够检测到蚕卵Eh基因的mRNA,提示在家蚕滞育卵诱发条件下胚胎期已经开始合成EH。比较25LL与20LD二种环境条件下Eh基因的表达差异,发现25LL条件下蚕卵的Eh基因表达水平总体高于20LD的蚕卵;胚胎发育后期,在积温高于2 160℃.h（单眼形成时期及单眼形成）后,Eh基因表达水平显著上调,这与在此阶段的蚕卵胚胎对滞育诱导环境温度和光照节律更加敏感相一致。亲代卵催青期25LL条件所产滞育卵中,Eh基因mRNA表达水平很低,在胚胎进入滞育后,则几乎检测不到Eh基因mRNA。而亲代15℃催青温度条件下所产子代非滞育性卵,无论是胚胎发生期间,还是其后的胚胎组织器官发育时期,都检测出一定含量的Eh基因mRNA。催青期在25LL、20LD、15DD环境下,均能检测到蚕卵Pitx基因的mRNA,且25LL条件下蚕卵的Pitx基因表达水平总体高于20LD和15DD的蚕卵。家蚕胚后时期25LL条件下Pitx的表达水平总体要高于15DD条件下的表达水平。亲代25LL催青环境下,子代滞育性卵在卵龄12-24 h胚胎发生期间,Pitx基因mRNA的含量快速增加,但随后迅速减少,至卵龄72 h后胚胎逐渐进入滞育阶段,卵内几乎检测不到Pitx基因的mRNA;而亲代15℃催青温度条件下所产子代非滞育性卵,无论是卵龄12-24 h的胚胎发生期间,还是其后的胚胎组织器官发育时期,都能检测出Pitx基因mRNA的表达;亲代20LD催青条件下所产子代卵,在12-192 h期间Pitx基因mRNA含量一直高于滞育性卵与非滞育性卵。胚胎发育时期Pitx的表达与Dh-pban的表达相一致。

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第一章文献综述

1 昆虫滞育

1.1 滞育前期

1.1.1 滞育诱导

1.1.2 滞育准备期

1.2 滞育期

1.2.1 滞育进入

1.2.2 滞育维持期

1.2.3 滞育打破

1.3 滞育后期

2 家蚕滞育诱导的环境条件

2.1 光周期

2.2 温度

3 家蚕滞育相关内分泌基因

3.1 促前胸腺激素基因Ptth

3.2 滞育激素—性信息素合成激活肽基因Dh-pban

3.3 羽化激素基因Eh

3.4 垂体同源框激素基因Pitx

第二章研究内容与基本实验方法

1 研究内容

2 常用材料与试剂

2.1 菌种与蚕品种

2.2 主要试剂

2.3 培养基

2.4 缓冲液和常用溶液

2.5 核酸电泳相关试剂

2.6 生物信息学资源及分析软件

3 主要仪器设备

4 基本实验方法

4.1 总RNA 的抽提

4.2 RNA 反转录

4.3 PCR 扩增反应程序及加样体系

4.4 PCR 产物的回收

4.5 连接反应

2 法制备E.coli 感受态细胞'>4.6 CaCl₂ 法制备E.coli 感受态细胞

4.7 重组DNA 的转化

4.8 重组质粒的筛选

4.9 碱裂解法少量制备质粒DNA

4.10 酶切反应

第三章滞育诱导温度和光照节律对家蚕滞育相关内分泌基因表达的影响

1 材料与方法

1.1 供试家蚕品种

1.2 亲代蚕卵处理方法

1.3 胚后时期蚕体与组织的取样方法

1.4 子代卵处理方法

1.5 样品总RNA 的提取及cDNA 第1 链的合成

1.6 家蚕Ptth、Dh-pban、Eh 和Pitx 基因的表达谱分析

2 结果与分析

2.1 家蚕促前胸腺激素基因Ptth

2.1.1 催青期滞育诱导温度和光照对家蚕卵 Ptth 基因表达的影响

2.1.2 滞育诱导温度和光照条件对家蚕胚后时期Ptth 基因表达的影响

2.1.3 家蚕Ptth 基因的芯片表达谱分析

2.1.4 家蚕亲代卵催青温度和光照条件对子代卵Ptth 基因表达的影响

2.2 家蚕滞育激素—性信息素合成激活肽基因Dh-pban

2.2.1 催青期滞育诱导温度和光照对家蚕卵 Dh-pban 基因表达的影响

2.2.2 滞育诱导温度和光照条件对家蚕胚后时期 Dh-pban 基因表达的影响

2.2.3 家蚕Dh-pban 基因的芯片表达谱分析

2.2.4 家蚕亲代卵催青温度和光照条件对子代卵 Dh-pban 基因表达的影响

2.3 家蚕羽化激素基因Eh

2.3.1 催青期滞育诱导温度和光照对家蚕卵 Eh 基因表达的影响

2.3.2 滞育诱导温度和光照条件对家蚕胚后时期Eh 基因表达的影响

2.3.3 家蚕Eh 基因的芯片表达谱分析

2.3.4 家蚕亲代卵催青温度和光照条件对子代卵Eh 基因表达的影响

2.4 家蚕同型框基因 Pitx

2.4.1 催青期滞育诱导温度和光照对家蚕卵 Pitx 基因表达的影响

2.4.2 滞育诱导温度和光照条件对家蚕胚后时期 Pitx 基因表达的影响

2.4.3 家蚕Pitx 基因的芯片表达谱分析

2.4.4 家蚕亲代卵催青温度和光照条件对子代卵Pitx 基因表达的影响

3 讨论

3.1 家蚕Ptth 基因表达具有显著的组织差异性

3.2 诱导子代滞育卵发生的温度与光照条件上调家蚕Dh-pban 基因表达

3.3 光照与温度对家蚕Eh 和Pitx 基因在各个时期表达的影响不同

第四章综合结论

1 家蚕滞育相关内分泌基因的表达存在显著的组织差异性

2 诱导子代滞育卵发生的高温与光照条件上调家蚕Dh-pban 基因表达

3 滞育诱导温度和光照节律对家蚕羽化激素基因 Eh 和垂体同源框激素基因Pitx 表达谱的影响

参考文献

研究生期间发表文章

论文资助项目

附录

文中所用缩略语一览表

致谢

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