导读:本文包含了托品酮还原酶论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:马尿泡,莨菪碱,托品酮还原酶,托品酮
托品酮还原酶论文文献综述
向敏[1]（2018）在《马尿泡托品酮还原酶基因克隆与功能分析》一文中研究指出托品烷生物碱(Tropane alkaloids,TAs)是临床上广泛应用的抗胆碱药物,是一种主要存在于茄科植物的次生代谢产物。市场上使用的托品烷生物碱主要依赖于从植物中提取,产量低价格昂贵,因此利用代谢工程手段提高植物中托品烷生物碱的产量具有十分重要的意义。基因工程的发展使得运用代谢工程手段改造TAs生物合成途径成为可能,而代谢工程手段的应用依赖于对托品烷生物碱代谢途径的生物化学和分子生物学研究。马尿泡(Przewalskia tangutica)是一种传统的藏药植物,多生于青藏高原。其根中含有丰富的莨菪碱(主要生物碱成分),莨菪碱的含量为干重的1.67%-3.83%,总生物碱含量为干重的2.06%-4.01%,是理想的TAs药源植物之一。目前为止,关于马尿泡中托品烷生物碱生物合成途径基因的研究还鲜有报道。托品酮还原酶(Tropinone reductase,TRs)分为托品酮还原酶I(Tropinone reductase I,TRI)和托品酮还原酶II(Tropinone reductase II,TRII)。托品酮还原酶I和II作为生物碱合成途径上的一个分支点,分别将托品酮还原成托品和假托品。托品是托品烷生物碱分子结构中托品环的直接来源,而假托品作为分支途径,使托品酮流向了其他的次生代谢产物。本研究以马尿泡为研究对象,分析比较其他已报道的茄科物种托品酮还原酶基因序列,利用RACE技术,克隆得到了PtTRI和PtTRII。PtTRI的cDNA全长为1176 bp,包含822 bp的编码区,编码274个氨基酸,70 bp的5′UTR和284 bp的3′UTR,终止密码子为TGA。PtTRII的cDNA全长为981bp,包含783 bp的编码区,编码261个氨基酸,87 bp的5′UTR和111 bp的3′UTR,终止密码子为TAA。经过GC-MS鉴定重组PtTRI和PtTRII体外催化产物,结果表明PtTRI和PtTRII具有生物学功能,能够分别将托品酮分别还原为托品和假托品。在大肠杆菌Rosetta菌株中异源表达PtTRI和PtTRII,对其进行了酶动力学分析。PtTRI还原反应最适pH为6.4,这也接近植物细胞的生理pH点,而氧化反应最适pH为10.6。PtTRI催化托品酮的Km和Kcat/Km分别为0.52±0.10 mM,42.26 s~(-1)·mM~(-1)。PtTRI催化托品的Km为0.07±0.00 mM,Kcat/Km为100.11 s~(-1)·mM~(-1)。结果显示PtTRI对底物托品有一个更高的亲和力和催化能力,但是其酶动力学测定是在pH 10.6进行的,属于强碱性环境,而植物细胞处于弱酸性环境,所以在马尿泡体内主要是还原反应占主导优势。PtTRII还原反应最适pH为6.8,而PtTRII对托品酮的Km为0.087±0.02 mM,Kcat/Km为116.90 s~(-1)·mM~(-1),说明PtTRII对托品酮的亲和力和还原活性远高于PtTRI。PtTRI与其他物种中的托品烷生物碱相关基因如PMT、H6H等显示出相似的组织表达特征,在根中大量表达,而在叶片和茎中少量表达。PtTRII则在根和茎的表达量都很高。PtTRI的表达模式说明了地下部分是TAs合成的主要场所,地上部分有可能也参与了TAs的合成。本文通过对PtTRI和PtTRII功能的研究,同时比较马尿泡与其他茄科物种如铃铛子、曼陀罗等植物中托品酮还原酶I的催化活性,结果表明马尿泡托品酮还原酶I是具有很高的还原活性,这一结果可为托品烷生物碱合成代谢调控提供新思路。(本文来源于《西南大学》期刊2018-04-08）
林榕燕,叶秀仙,钟淮钦,黄敏玲[2]（2017）在《霍山石斛托品酮还原酶基因的克隆及其表达分析》一文中研究指出为了探究托品酮还原酶(tropinone reductase,TR)基因在石斛中的功能,该研究采用RT-PCR结合RACE技术,以霍山石斛原球茎为材料,克隆得到霍山石斛TR-I基因的cDNA序列,其在Gen Bank中的登录号为KY912085。TR-I基因的cDNA长1 043 bp,包含一个完整的共807 bp的ORF(open reading frame)(79-885),共编码268个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白质可能是一种疏水性稳定蛋白质,无信号肽,不含卷曲螺旋结构,具有14个功能位点、47个潜在磷酸化位点,其二级结构由螺旋、折迭和卷曲结构组成。系统进化树分析表明,霍山石斛TR-I与铁皮石斛、金钗石斛的亲缘关系较近,处于同一分支。qPCR结果显示,TR-I基因在霍山石斛不同生长期的相对表达量均表现为茎>叶>根,且茎和叶中TR-I的表达量均随着生长期的延长呈现低–高–低的变化趋势;在不同品种中,金钗石斛的TR-I基因相对表达量最高,铁皮石斛中最低;不同浓度茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)处理比较,100μmol/L茉莉酸甲酯处理下TR-I基因表达量最高,推测该基因可能参与霍山石斛生物碱的合成途径。(本文来源于《中国细胞生物学学报》期刊2017年09期）
夏科[3]（2016）在《木本曼陀罗托品酮还原酶Ⅰ基因克隆及功能验证》一文中研究指出托品烷类生物碱(Tropane alkaloids,TAs)主要提取自茄科植物,包括莨菪碱(hyoscyamine)、山莨菪碱(anisodamine)和东莨菪碱(scopolamine),而莨菪碱和东莨菪碱是两种作为抗胆碱药物而被广泛应用于副交感神经系统,因而临床上常应用于镇痛、麻醉、抗晕动药、治疗帕金森症、改善微循环、戒毒脱瘾、治疗农药中毒等。山莨菪碱作为非特异性胆碱受体拮抗剂,其药理性与莨菪碱相似,然而东莨菪碱与莨菪碱相比较,其在临床上具有药效更强而副作用更小的特点,因而具有更大的市场价值。但是在茄科植物中东莨菪碱的含量极低,而利用人工合成的方法其成本太高且困难,因而在茄科植物中,通过代谢工程以获得高产东莨菪碱的药用植物将成为我们研究的一个方向。木本曼陀罗(Brugmansia arborea)属于茄科(solananaceac)曼陀罗属(Datura)的植物,根据前人报道的文献可知,木本曼陀罗的东莨菪碱含量极高,其化学型属于东莨菪碱型,因而我们以此为研究材料,通过同源物种(Datura stramonium和Datura innoxia)的托品酮还原酶Ⅰ(tropinone reductase I,TRI)基因序列比对,并分析保守区域的基因序列,利用RACE的方法,从B.arborea中克隆而获到一条TRI序列,BaTRI全长序列为1138-bp,包括41-bp的5’UTR、278-bp的3’UTR和819-bp的开放性阅读框(Open Reading Frame,ORF),该编码区能编码272个氨基酸,通过与其它已知的TRI氨基酸序列进行比对分析后,该氨基酸序列具有TRI功能必需的的结构域;通过体外重组技术,并在Rosstar中高效表达BaTRI,能纯化出大小约为30kDa的重组蛋白,与预测的29.7kDa相一致,同时为了与已经报道的DsTRI进行比较,我们从D.stramonium中克隆并获得编码DsTRI基因序列;对重组BaTRI酶动力学参数进行测定,其结果显示:以托品酮作为测定底物时,BaTRI的高还原活性能维持在一个很宽的pH范围(从6.8-8.0),而在8.0时活性最高,当以托品作为测定底物时,BaTRI的高氧化活性只能维持在一个很小的pH范围,而在9.6时活性最高。我们以6.4(植物的生理活性pH)作为酶动力学测定值,BaTRI对托品酮底物的Km、Vmax和Kcat分别为2.65 mM、88.30 nkat.mg-1和2.93 S-1,同时,也对两种托品酮的底物类似物进行了测定:4-甲基环己酮(4-methylcyclohexanone)和3-奎宁环酮盐酸盐(3-quinuclidinone hydrochloride),它们分别为单列酮和双环酮的典型底物,常被用于托品酮还原酶的鉴定。此外,在9.6时还测定了BaTRI对托品的相关酶动力学参数,其Km、Vmax和Kcat分别为0.56 mM、171.62 nkat.mg-1和0.54 S-1,结果显示BaTRI对托品的Km小于BaTRI对托品酮Km,但是两个反应的pH不一样,BaTRI对托品酮的反应处在弱酸性而BaTRI对托品的反应却处在强碱性,当在弱酸性范围时BaTRI对托品反应极低,而植物的生理PH为6.4,说明在B.arborea体内主要是还原反应占主导优势。为了与DsTRI进行酶活性比较,相同条件下,测定了DsTRI对托品酮底物的Km、Vmax和Kcat,它们的值分别为4.18 mM、81.20 nkat.mg-1和2.40 S-1,测定的结果显示BaTRI的Km小于DsTRI的Km,说明BaTRI对托品酮的亲和力更高,为了更好的说明BaTRI还原活性高于DsTRI,在6.4、6.8和7.0时同时测定了BaTRI和DsTRI对5mM托品酮的Kcat,结果显示BaTRI在6.4、6.8和7.0时对5mM托品酮的Kcat都高于DsTRI的Kcat,说明BaTRI对托品酮的催化效率更高,从而显示BaTRI的活性高于DsTRI;利用qPCR方法研究BaTRI在各组织中的表达情况,结果显示,BaTRI在各组织中都有表达,而在须根中的表达量最高,其表达模式与之前我们实验组所报道的BaH6H表达模式相一致,但是与所报道的几个草本物种的表达模式有很大区别;利用HPLC分析各组织中TAs的含量,结果显示,B.arborea主要含有东莨菪碱,而叶片和茎枝中的含量高于其他部位,说明B.arborea与D.stramonium和Hyoscyamus Niger一样,其化学型属于东莨菪碱型植物。BaTRI的表达模式和TAs的含量分布说明,在B.arborea中,地下部分是TAs合成的主要场所,地上部分也同时参与了TAs的合成。本文通过对BaTRI功能验证的研究,可以确定木本曼陀罗托品酮还原酶I的活性很高,为我们以后对TAs合成途径上的TRI靶位点进行改造时,提供一个更高效的候选基因,以便能得到高产东莨菪碱的药用植物。(本文来源于《西南大学》期刊2016-05-22）
王亚雄[4]（2014）在《颠茄类托品酮还原酶基因克隆及功能研究》一文中研究指出托品烷类生物碱(tropane alkaloids, TAs)是来源于茄科植物的一类次生代谢产物。莨菪碱(hyoscyamine)和东莨菪碱(scopolamine)是TAs中最为重要的两种生物碱,在临床上是应用广泛的抗胆碱类药物。颠茄是TAs最主要的商业栽培药源植物,但莨菪碱和东莨菪碱含量均较低。因此,培育TAs高产药源植物成为相关产业长期追求的目标。近年来,代谢工程的兴起使得遗传改造TAs生物合成途径成为可能,而代谢工程依赖于对该途径的分子生物学和生物化学研究。本研究基于已有EST测序结果,采用RACE方法从颠茄中克隆到了一个类托品酮还原酶基因(tropinone reductase like, TRL) cDNA全长,命名为AbTRL1,并进行了生物信息学分析。在之前的实验中,本实验室还克隆到另一个TRL基因时cDNA全长,命名为AbTRL2,生物信息学分析发现其可能是颠茄托品酮还原酶Ⅱ,但并未对其进行进一步的功能验证。本研究构建了这两个基因的数字表达谱和诱导谱,在大肠杆菌中进行原核表达并纯化获得了重组蛋白质结合前体饲喂验证其功能,对AbTRL1相关氨基酸位点进行定点突变并验证突变后重组蛋白的酶活。最终结果表明：AbTRL2对托品酮和假托品均有催化活性;AbTRL1对托品酮和托品均没有催化活性,但定点突变Y110H后对托品酮有一定的催化活性。托品酮还原酶(tropinone reductase, TRs)是TAs合成途径中分支处的控制点酶,分为托品酮还原酶Ⅰ (tropinone reductase, TR Ⅰ)、托品酮还原酶Ⅱ(tropinone reductase, TR Ⅱ)两种类型。TR Ⅰ能够将托品酮(tropinone) 3位的羰基还原为α-羟基,形成托品(tropine); TRⅡ可以将托品酮3位的羰基还原为p-羟基,形成假托品(pseudotopine)。本研究以颠茄为材料,采用RACE技术,获得了AbTR1基因,其cDNA全长为1078 bp,包含一段长度为816 bp的编码区、14 bp的5'UTR和248 bp的3'UTR,polyA长度为15bp,终止密码子为TAA。其编码区编码一段含271个氨基酸残基的多肽,其预测分子量大小约为29.7 kD,等电点(pI)为6.75。对推断的AbTRL1基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析,结果显示,AbTRL1与已报道的茄科其它物种的托品酮还原酶氨基酸序列相似性均在80%以上；从发育进化树上发现,AbTRL1在遗传距离上介于TRⅠs和TRⅡ。s之间,且与TRⅠs更近一些；保守结构域预测发现,AbTRL1的氨基酸序列中存在典型的短链脱氢酶(short-chain dehydrogenase/reductase, SDR_c)特征性结构域,这与已经被鉴定的曼陀罗和莨菪的TRs属于SDR家族这一事实相吻合：叁级结构预测发现,在AbTRL1的N端SDR所需要的NADPH结合区域,存在SDR优先结合NADPH的保守氨基酸残基Lys29和Arg51,但是在C端,底物托品酮结合区域中的3个对底物与酶结合起着关键作用的氨基酸,只有Alal58是一致的, 其余两个均不一致。数字表达谱和诱导表达谱分析表明,AbTRL1和AbTRL2在各个器官均有表达,属于组成型表达基因。AbTRL1在各个器官中表达差异不大,只在叶中表达量较低；AbTRL2除在成熟果中表达量较低外,在其他器官中表达量差异不大。AbTRL1和AbTRL2表达水平均受到ABA调控。在大肠杆菌中进行原核表达,对AbTRL1和AbTRL2重组蛋白进行纯化后,以托品酮、4-甲基环己酮(4-methylcyclohexanone)、3-奎宁酮盐酸盐(3-quinuclidinone hydrochloride)和托品、假托品为反应底物分别检测AbTRL1和AbTRL2重组蛋白的还原反应和氧化反应活性并测定Km、Vmax等酶活参数。蛋白酶活测定结果显示：AbTRL1蛋白对4-甲基环己酮有一定的催化活性,而对托品酮和3-奎宁酮盐酸盐不具有催化活性；而AbTRL2对托品酮、4-甲基环己酮和假托品均有催化活性,只对3-奎宁酮盐酸盐都没有催化作用。对AbTRL1的活性位点进行定点突变(Y110H),构建原核表达载体pET28-AbTRL1-Y110H并在Rosetta中进行原核表达。对AbTRL1-Y100H重组蛋白进行纯化后,以托品酮为反应底物,检测AbTRL1-Y110H的酶活并测定Km、Vmax等酶活参数,结果发现,AbTRL1-Y110H对托品酮具有催化活性。本研究通过对AbTRL1和AbTRL2功能的验证,表明AbTRL2为颠茄托品酮还原酶Ⅱ；同时首次在颠茄中克隆到了除TRⅠ和TRⅡ外的一个类托品酮还原酶基因AbTRL1,这是第一次在颠茄TRs中发现了新成员,通过对其生物信息学的分析,发现这叁个TRs可能在进化上存在密切关系。AbTRL1本身不具有催化托品酮的活性,但是其突变体(Y110H)对托品酮产生了催化活性,这也说明了His110是托品酮还原酶的一个重要位点。这一研究对进一步了解TRs提供了实验基础。(本文来源于《西南大学》期刊2014-05-20）
周振华[5]（2011）在《金钗石斛托品酮还原酶同源基因的克隆及表达分析》一文中研究指出金钗石斛(Dendrobium nobile)是我国传统名贵中药,为兰科石斛属多年生草本植物,有滋阴清热,生津止渴。用于热病伤津、口渴舌燥、病后虚热等功效。金钗石斛体内次生代谢产物丰富,且都具有重要的药用价值,对金钗石斛次生代谢途径中关键酶基因的研究具有重要的理论和实际应用意义。本实验通过构建金钗石斛EST文库,成功筛选获得托品酮还原酶类似基因DnTRI及DnTRII,生物信息学分析发现DnTRI, DnTRII基因在序列上同已知的TR或SDR基因具有较高的同源性,在进化关系上与SDR家族基因更近。通过构建原核表达载体并分离纯化获得了DnTRI, DnTRII基因表达蛋白,为进一步研究该基因的功能打下了基础。此外还通过荧光定量技术分析了基因在金钗石斛不同组织内的表达差异及不同信号分子诱导下的表达差异。论文的主要研究成果有：1,根据EST数据库获得的基因序列设计引物成功克隆出DnTRI及DnTRII基因ORF区序列,测序结果显示DnTRI基因ORF大小为816bp,编码272个氨基酸。DnTRII基因ORF大小为804bp,编码268个氨基酸。蛋白序列分析表明DnTRI, DnTRII与已报道过的TR类同源性在93%-98%之间。2,利用荧光定量PCR分析基因组织特异性表达,发现金钗石斛中DnTRI基因在叶中表达最高,茎中次之,根中表达最低；DnTRII基因在各个组织中表达差异不明显,在叶中表达最高,根中次之,茎中表达最低。用茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、一氧化氮供体(SNP)处理金钗石斛组培苗,处理时间分别为4h、8h、16h和24h。荧光定量PCR结果显示：相对于对照组,在经茉莉酸甲酯处理4小时后DnTR基因表达量开始增加,到24小时DnTRI相对表达量达到最高。DnTRII处理4小时和8小时后表达量均有增加,处理16小时后表达量基本与对照组持平,处理24小时后相对表达量达到最高。DnTRI在SNP处理4小时之后相对表达量有所减少,处理8小时后DnTRI表达量基本与对照组持平,16小时和24小时基因表达量要高于对照组,其中16小时处理DnTRI相对表达量最大。DnTRII表达水平在处理4,8,16,24小时时基因表达量均小于对照组。经SA处理4小时后DnTRI和DnTRII相对表达量减少,处理8小时,16小时,24小时后DnTRI相对表达量有所增加,在处理8小时时相对表达量最高。结果表明,这叁种信号分子对DnTRI及DnTRII的表达均有影响。3,构建了原核表达载体,纯化获得了DnTRI及DnTRII在大肠杆菌中的表达产物,SDS-PAGE结果显示,DnTRI及DnTRII在大肠杆菌中不受IPTG浓度不同所影响。蛋白酶活测定结果显示：DnTRI蛋白对4-methylcyclohexanone和3-奎宁酮盐酸盐这两种底物具有催化活性,对托品酮则不具有催化活性；DnTRII蛋白对这叁种底物具有催化活性。该实验结果有助于寻找DnTRI和DnTRII在金钗石斛中的特异性底物。(本文来源于《杭州师范大学》期刊2011-06-01）
彭静叶,彭梅芳[6]（2011）在《反义托品酮还原酶Ⅱ基因对叁分叁的遗传转化及生物碱含量测定》一文中研究指出[目的]通过反义托品酮还原酶Ⅱ基因提高托品酮还原酶I(TRI)的表达水平,从而增加莨菪碱在叁分叁中的含量,为大规模开发生产托品烷生物碱提供理论基础。[方法]将携带反义托品酮还原酶Ⅱ基因的重组工程菌C58C1-p1304+-antTRⅡ采用叶盘法对叁分叁进行遗传转化。潮霉素筛选转基因发根,PCR检测转基因发根基因组中是否同时含有rolB、rolC和Hygr抗性基因。PCR阳性转基因发根扩大培养后,提取生物碱,并采用高效液相色谱法进行生物碱含量测定。[结果]共有9个转基因发根的基因组同时检测到rolB、rolC和Hygr抗性基因,且这9个转基因发根中的莨菪碱含量较对照有不同程度的提高。[结论]反义托品酮还原酶II基因对托品烷生物碱代谢途径起到一定程度的正调控作用。(本文来源于《安徽农业科学》期刊2011年12期）
托品酮还原酶论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
为了探究托品酮还原酶(tropinone reductase,TR)基因在石斛中的功能,该研究采用RT-PCR结合RACE技术,以霍山石斛原球茎为材料,克隆得到霍山石斛TR-I基因的cDNA序列,其在Gen Bank中的登录号为KY912085。TR-I基因的cDNA长1 043 bp,包含一个完整的共807 bp的ORF(open reading frame)(79-885),共编码268个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白质可能是一种疏水性稳定蛋白质,无信号肽,不含卷曲螺旋结构,具有14个功能位点、47个潜在磷酸化位点,其二级结构由螺旋、折迭和卷曲结构组成。系统进化树分析表明,霍山石斛TR-I与铁皮石斛、金钗石斛的亲缘关系较近,处于同一分支。qPCR结果显示,TR-I基因在霍山石斛不同生长期的相对表达量均表现为茎>叶>根,且茎和叶中TR-I的表达量均随着生长期的延长呈现低–高–低的变化趋势;在不同品种中,金钗石斛的TR-I基因相对表达量最高,铁皮石斛中最低;不同浓度茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)处理比较,100μmol/L茉莉酸甲酯处理下TR-I基因表达量最高,推测该基因可能参与霍山石斛生物碱的合成途径。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
托品酮还原酶论文参考文献
[1].向敏.马尿泡托品酮还原酶基因克隆与功能分析[D].西南大学.2018
[2].林榕燕,叶秀仙,钟淮钦,黄敏玲.霍山石斛托品酮还原酶基因的克隆及其表达分析[J].中国细胞生物学学报.2017
[3].夏科.木本曼陀罗托品酮还原酶Ⅰ基因克隆及功能验证[D].西南大学.2016
[4].王亚雄.颠茄类托品酮还原酶基因克隆及功能研究[D].西南大学.2014
[5].周振华.金钗石斛托品酮还原酶同源基因的克隆及表达分析[D].杭州师范大学.2011
[6].彭静叶,彭梅芳.反义托品酮还原酶Ⅱ基因对叁分叁的遗传转化及生物碱含量测定[J].安徽农业科学.2011