论文摘要
锯缘青蟹（Scylla serrata）是我国主要的海水甲壳类养殖品种,总产量达到10.85万吨,占世界总养殖产量的88.14%。近年来养殖锯缘青蟹发生大规模疾病和死亡。青蟹发生的疾病有黄水病、弧菌病、纤毛虫病、白芒病、褐斑病、黄斑病等,病原包括细菌、病毒、环境因素及不明病因的疾病。2006年青蟹全国平均发病率为13.77%左右,全年经济损失为2.29亿元,严重制约了青蟹养殖健康可持续发展。作者研究了温度、pH、促进剂、抑制剂、菌体及免疫多糖对锯缘青蟹血细胞裂解物（HLS）酚氧化酶（phenoloxidase,PO）活力的影响。试验结果表明:锯缘青蟹PO的最适作用温度为25℃,最适pH值为7.8;SDS、Ca2+、Mg2+均可提高PO的活力,其中Ca2+和Mg2+的最佳反应浓度分别为50 mmol/L和150 mmol/L,SDS的最佳反应浓度为2.5 mg/mL;叠氮钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠、乙二胺四乙酸、Cu2+对PO活力有不同的抑制作用。发现拟态弧菌SS060818、气单胞菌MrM0602、金黄色葡萄球菌ATCC25923、溶壁微球菌AS1.634对PO有激活作用,其中拟态弧菌和气单胞菌激活作用显著,金黄色葡萄球菌、溶壁微球菌对PO有弱激活作用;肽聚糖、拟态弧菌脂多糖粗提物可显著提高PO活力,肽聚糖、脂多糖的最佳激活浓度2.7 mg/mL、0.5 mg/mL。此外,建立了超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶、吞噬等青蟹非特异性免疫指标的测定方法。通过酚氧化酶体外增强试验,开展了青蟹免疫增强的筛选试验。选择了30多种中草药和食用菌,提取其免疫多糖,测定了免疫多糖对青蟹血淋巴酚氧化酶（PO）的增强作用。结果表明白术多糖、木耳多糖、金银花多糖、大黄多糖、猪苓多糖、陈皮多糖、CIS-1、CIS-2等均可显著提高PO活力,其最佳激活浓度范围为0.03 125μg/mL—0.125 mg/mL,其他多糖对PO促进作用较弱或无作用。选择CIS-1、CIS-2、连翘多糖分别以7.5×10-3mg/mL、0.031 mg/mL和1.25×10-4mg/mL对锯缘青蟹进行免疫注射实验,定期测定青蟹血淋巴的超氧化物岐化酶（SOD）、碱性磷酸酶（ALP）、过氧化物酶（POD）、酚氧化酶（PO）、血清抗菌活力和血细胞吞噬活力等指标。CIS-1、CIS-2、连翘多糖注射后,青蟹过氧化物酶（POD）、酚氧化酶（PO）活力和血细胞吞噬活性比对照组均有不同程度的提高;注射CIS-124h后,血淋巴SOD活性比对照提高了18.2%（由12.76 U/mgprot提高到15.08U/mgprot）,ALP比对照组提高了75%（0.52 U/mL提高到0.91 U/mL）;青蟹注射CIS-2和连翘多糖后,血淋巴SOD和ALP活性无明显提高。青蟹注射免疫多糖后,连翘多糖的抗菌活力未见明显提高,表明上连翘多糖对青蟹血清抗菌活力无明显增强作用。青蟹注射免疫多糖后,各组养殖箱中投入青蟹有较强致病力的拟态弧菌SS060818（V.minicus）,终浓度为1×107cfu/mL。试验表明,注射CIS-1、CIS-2、连翘多糖组青蟹平均存活期比对照组分别增长55.92%、139.35%、12.43%。表明免疫多糖可提高青蟹对拟态弧菌的抵抗力。根据锯缘青蟹免疫增强剂注射试验结果,选择能显著提高锯缘青蟹免疫指标和存活率的CIS-1、CIS-2、PG、LPS作为免疫增强剂添加到饲料投喂青蟹,结果表明:投喂CIS-1、CIS-2、PG、LPS后,青蟹血淋巴过氧化物酶、酚氧化酶、碱性磷酸酶活力比对照组均有不同程度的提高;CIS-2试验组第6d ALP、POD和PO活力显著高于对照组,其中ALP活力达0.74U/mL,比对照提高155%;SOD活力第11d比对照提高了180%,显著高于对照组;投喂CIS-1和PG后青蟹血清中ALP活力在11d达到最高值,投喂PG、LPS第15d血清中的SOD活力显著高于对照组;各免疫组血清抗菌活力在第6d达到最大值,但差异不显著。投喂免疫多糖20d后,投入青蟹有较强致病力的拟态弧菌SS060818（V.minicus）,终浓度为1×107cfu/mL感染青蟹,投喂CIS-1、CIS-2、PG、LPS组青蟹平均存活期比对照组分别增长了44.57%、104.51%、31.59%、78.70%,表明免疫多糖可提高青蟹对拟态弧菌的抵抗力。锯缘青蟹越冬养殖用CIS-1、CIS-2、PG、LPS注射免疫锯缘青蟹,测定青蟹血淋巴中ALP,SOD,PO,POD,血清抗菌活力等指标,结果表明:试验组ALP活力均高于对照组,其中以CIS-2效果最好,SOD、POD和PO的活力最高值分别可达18.55U/mgprot、0.16 U/mL和38.16 U/mL,分别比对照提高了50%、100%、176%,ALP活力仍处于较高水平;注射CIS-1和LPS的POD活力都在16d达到最高值为0.14 U/mL,比对照提高75%,作用效果显著;注射LPS后血清中ALP、PO活力在与对照组相比变化不明显;越冬45d后计算各试验组青蟹存活率,CIS-1、CIS-2、PG存活率分别为73%、82%、70%,均高于对照组。在生产性青蟹越冬池中,注射CIS-1和CIS-2,15d后测定青蟹血清的各免疫指标ALP、PO、SOD活力跟对照相比均有所提高,30d后CIS-1和CIS-2注射组的存活率为71%、88%,比对照组提高分别20.33%、49.15%,表明免疫多糖可提高青蟹的免疫力和存活率,有良好的应用前景。