鱼腥藻PCC7120 all0012基因的初步研究

论文摘要

目前,水华现象在世界范围内普遍发生,已经影响到了人们正常的生活、生产活动。水华是由于富营养化的湖水中蓝藻疯长引起,在做好水污染治理的同时,研究怎样抑制蓝藻的生长繁殖,已成为水华防治的主要方向。Shen等在聚球藻Synechococcus sp. strain PCC 7002和集胞藻Synechocystis sp. strain PCC 6803中确认出编码甲基转移酶的基因cpcM,而其编码的CpcM是能甲基化CpcB、ApcB和ApcF中Asn71/72位点N端的酶,这种甲基化过程能够稳定PBP并在PBS的高效能量稳定传递过程中起着重要作用。通过比较生物信息学和基因邻近分析,确认出来自鱼腥藻Anabaena sp. strain PCC7120的高度保守的开放阅读框all0012为其同源编码基因。实验通过分子生物学的方法克隆含有上下游同源臂的all0012基因片段并引入链霉素抗性基因,构建克隆载体pBlue-L-str/sp-R后转入整合载体得到pRL271-L-str/sp-R并最终转至大肠杆菌,再以三亲本杂交法转化鱼腥藻PCC7120,重组子由壮观霉素在BG11平板上筛选。在不同光照强度下对比培养鱼腥藻PCC7120突变型和野生型生长状况;在弱光照下突变型和野生型生长至对数生长期的倍增时间变化并不明显,而在强光下all0012缺失突变体比对应的野生型敏感,显示出强光光敏性,推测all0012基因可能是编码Asn甲基化酶的基因或参与该甲基化过程。另外,通过SDS-PAGE对在大肠杆菌中表达的重组系统进行了检测和验证。结果表明基因序列选取正确,all0012基因可以在相应的异源体内重组系统中表达,表达产物All0012蛋白分子量与预期相同且表达产物存在于该细胞上清中。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 蓝藻及研究背景
• 1.1.1 蓝细菌与鱼腥藻PCC7120
• 1.1.2 蓝藻的基因工程应用
• 1.1.3 野生蓝藻生态危害
• 1.2 蓝藻的光合作用机制
• 1.2.1 藻胆蛋白与藻胆体
• 1.2.2 藻胆色素（phycobilin）
• 1.2.3 藻胆体（phycobilisome，PBS）
• 1.2.4 藻胆蛋白（phycobiliprotein，PBP）
• 1.3 蓝藻中天冬酰胺甲基转移酶基因cpcM
• 1.4 鱼腥藻PCC7120 的分子及遗传学操作
• 1.4.1 蓝藻质粒与载体构建
• 1.4.2 蓝藻外源基因转化
• 1.4.3 鱼腥藻突变株的筛选
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第2章 鱼腥藻 Anabaena PCC7120 基因 all0012 的生 物信息学分析
• 2.1 分析软件与方法
• 2.2 all0012 基因的分析结果
• 2.3 小结与讨论
• 第3章 突变体构建的材料与设计
• 3.1 本实验所用菌株与质粒
• 3.2 所用试剂与培养基配方
• 3.2.1 主要分子生物学试剂
• 3.2.2 培养基
• 3.2.3 其他溶液
• 3.2.4 主要仪器
• 3.3 实验设计
• 第4章 鱼腥藻（Anabaena PCC7120）all0012 相关基 因的克隆载体的构建
• 4.1 鱼腥藻PCC7120 藻总DNA 的提取
• 4.1.1 CTAB 法提取藻总DNA
• 4.1.2 石英砂法提取藻总DNA
• 4.1.3 CTAB 石英砂结合及超声破碎法
• 4.2 载体质粒DNA 的提取及其基因操作
• 4.2.1 裂解法提取质粒
• 4.2.2 DNA 片段的回收与质粒的酶切处理
• 4.2.3 质粒的去磷酸化
• 4.3 PCR 扩增与克隆质粒载体的构建
• 4.3.1 DNA 片段的PCR 扩增
• 4.3.2 转化大肠杆菌
• 4.3.3 PCR 鉴定
• 4.3.4 结果与分析
• 4.4 小结与讨论
• 第5章 鱼腥藻 PCC7120（Anabaena PCC7120）all0012 缺失体的构建
• 5.1 缺失体的体外克隆
• 5.1.1 抗性基因的获得与连接
• 5.1.2 Ｌ-str/sp-Ｒ片段与整合载体的连接
• 5.2 鱼腥藻PCC7120 对壮观霉素的基础抗性检测
• 5.3 通过三亲本杂交法对鱼腥藻PCC7120 进行基因转移及筛选
• 5.4 鱼腥藻 all0012 基因缺失的光敏性检测
• 5.5 小结与讨论
• 第6章 鱼腥藻 PCC7120 All0012 蛋白的表达检测
• 6.1 All0012 蛋白的表达
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 载体与菌株
• 6.2.2 主要分子生物学试剂
• 6.2.3 主要仪器设备
• 6.3 实验流程与方法
• 6.3.1 all0012 基因重组质粒表达载体的构建
• 6.3.2 IPTG 诱导的蛋白表达
• 6.3.3 诱导蛋白SDS-PAGE 检测样品的制备
• 6.3.4 SDS-PAGE 检测诱导蛋白
• 6.4 结果与分析
• 6.4.1 pET-all0012 的琼脂糖凝胶电泳检测
• 6.4.2 重组蛋白的SDS-PAGE 电泳检测
• 6.5 小结与讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录A 攻读硕士学位期间发表的论文