西北部分地区鸡眼草根瘤菌生物多样性及系统发育研究

论文摘要

本论文综述了根瘤菌多样性、分类和多相分类技术的研究进展;采用表型分析（113项生理生化测定,数值分类）和遗传型分析（16S rDNA PCR-RFLP、nifH PCR-RFLP、nodA PCR-RFLP,16S rRNA、nodA、nifH、recA基因序列分析）等多相分类技术,首次系统地对西北部分地区的53株鸡眼草根瘤菌进行了表型和遗传多样性及系统发育研究,初步确定了鸡眼草根瘤菌的系统发育地位。16S rDNA PCR-RFLP及其序列测定分析表明,所有供试菌株产生了11种16S rDNA基因型,归属于中华根瘤菌属（Sinorhizobium）,根瘤菌属（Rhizobium）,中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）,土壤杆菌属（Agrobacterium）和慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）5个系统发育分支上。从鸡眼草根瘤菌中分离出了土壤杆菌,其代表菌株CCNWSX0487、CCNWSX0483及CCNWSX0481与葡萄土壤杆菌（Ag. vitis）的亲缘关系最近,序列相似性为97.19%,但这三株菌与葡萄土壤杆菌（Ag. vitis）有明显差异,构成一个独立的分支,可能预示着新种的出现。此外,CCNWSX0493和CCNWSX0476也构成独立分支,有可能是潜在的新种。recA序列系统发育分析表明,供试菌株归类于土壤杆菌属、根瘤菌属、慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属。代表菌株以recA序列为基础的系统发育树与16S rDNA序列分析的系统发育的结果是一致的。但是也存在一定的差异,即代表菌株的recA序列与参比菌株序列同源性均小于其与16S rDNA序列的同源性。nodA PCR-RFLP及其序列分析表明供试菌株分布于慢生根瘤菌属、根瘤菌属、中慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属。CCNWSX0493、CCNWGS0088和CCNWSX0476这三株菌的以结瘤基因nodA序列为基础的系统发育树与16S rDNA序列分析的系统发育树存在较大差异。说明nodA基因可能在根瘤菌的不同种间发生了水平转移。nifH PCR-RFLP及其序列分析表明供试菌株分布于慢生根瘤菌属、中慢生根瘤菌属和中华根瘤菌属。供试菌株除CCNWSX0493在16S rDNA序列系统发育树上属于Rhizobium,在固氮基因nifH构建的系统发育树上属于Sinorhizobium之外,其余菌株的nifH基因的系统发育分析与16S rDNA的系统发育分析体现的较为一致,这也说明了西北地区鸡眼草根瘤菌的nifH基因序列具有一定的宿主专一性。对鸡眼草根瘤菌进行113项生理生化指标测试,结果表明不同地理来源,甚至来源于同一地区的不同鸡眼草根瘤菌菌株在碳、氮源利用、耐盐性、对苯酚抗性程度等方面存在着一定差异,12.5%的菌株能耐受300μg/mL氯霉素,58.9%的株菌能耐受2%的NaCl,38%的株菌能耐受700mg/L的苯酚。在数值分类中,所有供试菌株在60%的相似水平上聚在一起。在90%的相似水平上,参比菌株能够按不同的种彼此很好的分开,并将待测菌株主要分为五个表观群:群Ⅰ中华根瘤菌属Sinorhizobium,群Ⅱ根瘤菌属Rhizobium,群Ⅲ慢生根瘤菌Bradyrhizobium,群Ⅳ模式菌株和群Ⅴ土壤杆菌属Agrobacterium。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 根瘤菌多样性研究进展
• 1.2.1 根瘤菌表型分类方法
• 1.2.2 根瘤菌遗传型分类方法
• 1.2.3 根瘤菌的系统发育学研究
• 1.3 根瘤菌的分类进展
• 1.4 本研究的立题依据及研究意义
• 1.4.1 鸡眼草属概述
• 1.4.2 鸡眼草属根瘤菌的国内外研究进展
• 1.4.3 西北地区鸡眼草属根瘤菌的研究目的及意义
• 第二章 16Sr DNA 的PCR-RFL 及其系统发育研究和recA 基因片段系统发育学分析
• 2.1 16S rDNA PCR-RFLP 分析
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 结果与分析
• 2.2 16S rDNA 序列的相似性比较及系统发育学分析
• 2.2.1 16S rDNA 序列测定结果和系统发育学分析
• 2.2.2 讨论
• 2.3 recA 基因片段系统发育学分析
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.2 recA 基因片段序列测定结果和系统发育学分析
• 第三章 结瘤基因（nodA）和固氮基因（nifH）的PCR-RFLP 分析及系统发育研究
• 3.1 结瘤基因（nodA）限制性片段多样性（PCR-RFLP）研究
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 nodA 基因片段扩增
• 3.1.3 nodA 扩增片段的酶切与电泳
• 3.1.4 nodA 序列的测定及系统发育树的构建
• 3.1.5 nodA PCR-RFLP 分析
• 3.1.6 nodA 序列及系统发育树分析
• 3.1.7 讨论
• 3.2 固氮基因（nifH）限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）研究
• 3.2.1 材料与方法
• 3.2.2 nifH 片段扩增
• 3.2.3 nifH 扩增片段的酶切与电泳
• 3.2.4 nifH 的序列测定及系统发育树的构建
• 3.2.5 nifH PCR-RFLP 分析
• 3.2.6 nifH 序列及系统发育树分析
• 3.2.7 讨论
• 第四章 鸡眼草根瘤菌的表型多样性及数值分类研究
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 根瘤菌处理
• 4.1.2 生理生化特性测定
• 4.2 实验结果处理
• 4.2.1 性状编码
• 4.2.2 聚类分类
• 4.2.3 表观群中心菌株确定
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 生理生化测定结果分析
• 4.3.2 聚类分析结果
• 4.3 讨论
• 第五章 鸡眼草根瘤菌共生结瘤研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 菌种与种子
• 5.1.2 根瘤菌的回接方法
• 5.1.3 观察记录
• 5.2 结果与分析
• 第六章 讨论与结论
• 6.1 西北地区鸡眼草根瘤菌的生物多样性
• 6.2 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介