拟南芥感应细菌分子模式的分子机理研究

论文摘要

在自然界中,植物病原菌的感染一般通过叶表面的自然开口进入叶片内部。但是病原菌侵染植物叶片表面的瞬时反应以及其与微生物相关分子模式的关系,我们目前知之甚少。在本研究中,我们利用水母发光蛋白监测细胞质钙离子浓度动态变化这一技术,监测了丁香假单胞菌番茄致病变种（Pst DC3000）侵染离体拟南芥叶片表面后[Ca2+]cyt的动态变化。处理后叶片出现了显著的[Ca2+]cyt瞬时升高,且峰值与病原菌浓度呈正相关。研究表明,上升的[Ca2+]cyt主要来源于cAMP所介导的Ca2+途径,而不是对Gd3+敏感的Ca2+流入通道,这有别于单独的MAMP的诱导途径（如脂多糖、鞭毛蛋白和延长因子Tu）。此外,缺失鞭毛蛋白、Ⅲ型分泌系统和植物冠毒素的Pst DC3000突变体显著减弱了它们在叶外质体的增殖能力,但引起的细胞质内Ca2+浓度变化没有差别。结果表明,拟南芥叶片中的[Ca2+]cyt对于叶片表面接种病原菌具有过敏反应,但与病原菌的发病能力无关。细菌表面存在的病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）能够被宿主细胞质膜上的模式识别受体（Pattern-recognition receptors, PRRs）识别,并激发下游的基础防御反应。在动物细胞中,这种复合体具有感知LPS的功能。前人研究表明,动物和植物细胞在由PAMPs诱导的先天免疫的分子机制方面高度类似。在拟南芥中,我们发现AtGHRl与动物细胞的TLR4有高度同源的氨基酸序列。根据GUS基因组织特异性进行AtGHRl启动子活性的组织定位,发现其主要在叶片木质部和根尖部位表达,在保卫细胞中微弱表达。为确定AtGHRl的亚细胞定位,我们在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中共同瞬时表达了绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的细胞质膜标记蛋白,结果表明其定位于细胞质膜上。本研究发现拟南芥atghrl缺失突变体部分参与了由LPS诱导的细胞免疫反应,鉴定出植物中AtGHRl是LPS引发的自然免疫反应中的一个新型组分。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 第一章 文献综述
• 1. 主要模式植物介绍
• 1.1 拟南芥
• 1.2 水稻
• 1.3 短柄三叶草
• 2 植物免疫反应研究
• 2.1 植物细胞先天免疫的一般原理
• 2.2 病原相关分子模式（PAMPs）的介绍
• 2.3 TLRs家族
• 2+信号转导的研究进展'>2.4 Ca²⁺信号转导的研究进展
• 2.5 拟南芥与假单胞杆菌互作的模式系统
• 3. 本研究的目的和意义
• 参考文献
• 2+的升高与病原菌关系的研究'>第二章 Pst DC3000诱导拟南芥细胞质Ca²⁺的升高与病原菌关系的研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液与培养基旳配制
• 2.2 实验方法
• 3. 实验结果
• 2+]_cvt瞬变现象'>3.1 Pst DC3000悬液诱导拟南芥离体叶片的[Ca²⁺]_cvt瞬变现象
• 2+]_cyt升高途径进行抑制剂反应的实验'>3.2 对[Ca²⁺]_cyt升高途径进行抑制剂反应的实验
• 3.3 脱敏反应
• 3.4 发病能力应答的关系
• 4. 讨论
• 参考文献
• 第三章 拟南芥AtGHR1基因参与脂多糖诱导的先天免疫的分子机制研究
• 1. 引言
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种与质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要溶液与培养基的配制
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 引物设计与合成
• 2.2.2 pORE R1-AtGHR1 Promoter-GUS载体构建
• 2.2.3 植物农杆菌侵染
• 2.2.4 阳性植株的筛选
• 2.2.5 GUS染色
• 2.2.6 DNA的快速提取
• 2.2.7 AtGHR1-2 T-DNA突变体的纯合鉴定
• 2.2.8 植物细胞内过氧化氢浓度的测定
• 2.2.9 植物细胞质内钙离子浓度动态变化的测定
• 2.2.10 植物细胞内一氧化氮浓度的测定
• 2.2.11 菌侵染突变体的表型分析
• 2.2.12 在烟草叶片中的瞬时表达
• 2.2.13 转录组分析实验
• 2.2.14 感病性分析实验
• 3. 实验结果与分析
• 3.1 拟南芥中LPS候选受体基因AtGHR1的生物信息学分析
• 3.1.1 AtGHR1氨基酸序列的BLAST搜索
• 3.1.2 TLR4与AtGHR1的蛋白质结构分析
• 3.2 AtGHR1启动子活性的组织定位
• 3.3 AtGHR1的亚细胞定位
• 3.4 atghr1-2 T-DNA插入突变纯合体验证
• 3.4.1 atghr1-2 T-DNA插入突变体DNA水平验证
• 3.4.2 atghr1-2 T-DNA插入突变体RNA水平验证
• 2O₂和Ca²⁺的产生'>3.5 AtGHR1参与LPS诱导NO的产生,不参与H₂O₂和Ca²⁺的产生
• 3.6 拟南芥GHR1功能缺失突变体减弱了由脂多糖诱导的防御反应
• 3.7 AtGHRI介导了叶子中的转录组应答
• 4.讨论
• 参考文献
• 结论
• 致谢
• 论文发表情况