马铃薯茎尖的超低温保存及再生植株的遗传稳定性分析

论文摘要

植物种质资源是物种进化,遗传学研究和植物育种的物质基础,因此对于植物种质资源的保存是十分重要的。本试验采用玻璃化法超低温保存马铃薯试管苗茎尖,并对保存后再生植株进行了遗传稳定性分析,获得以下主要结果:1初步建立玻璃化超低温保存马铃薯茎尖的体系适合马铃薯品种大西洋（Atlantic）试管苗茎尖玻璃化超低温保存的体系:（1）试管苗培养:温度23℃,每天光照14h,光照强度20001x,培养时间40d;（2）在无菌条件下剥取试管苗茎尖约3mm长;（3）60%PVS2预处理:预处理时间40min,预处理温度25℃;（4）PVS2处理:处理时间50min,处理温度0℃;（5）快速降温,在液氮中保存24h;（6）38℃水浴解冻90s;（7）洗涤:洗液是:MS+1.2mol.L-1Sucrose+Vc2g.L-1PVP400mg.L-1。洗两次,每次10min,洗涤时的温度25℃;（8）恢复培养:培养基:MS+0.04mg.L-1KT+0.5mg.L-1IAA+0.5mg.L-1GA3+2%Sucrose+0.4%agar+Vc2g.L-1PVP400mg.L-1,先暗培养5d,再转入正常培养条件下培养。2获得适合马铃薯SRAP-PCR的体系和程序所用的反应程序是:94℃5min,1个循环;94℃1min,35℃1min,72℃2min,5个循环;94℃1min,50℃1min,72℃2min,40个循环;72℃延伸5min。试验中对体系的模板DNA、Taq酶、引物、MgCl2、dNTPs等五个关键因子进行了单因子试验,得到适合SRAP-PCR的反应体系:模板DNA1.0μL、Taq酶1.7μL、引物对1.5μL×2、MgCl22.4μL、dNTPs0.6μL、10×buffer3.0μL、ddH2018.3μL,总体积是30μL。3利用SRAP标记技术对超低温保存后再生植株的遗传稳定性进行检测,结果表明:利用试验中优化的超低温保存体系进行马铃薯茎尖的超低温保存,再生植株能够保持材料的原有性状和遗传特征。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1 马铃薯种质资源遗传多样性的意义
• 2 马铃薯种质资源保存的研究
• 2.1 马铃薯种质资源保存的主要方法
• 2.1.1 种子保存法
• 2.1.2 块茎保存法
• 2.1.3 田间种植保存法
• 2.1.4 试管苗保存法
• 2.1.5 离体超低温保存法
• 2.2 马铃薯种质资源超低温保存的研究进展
• 3 玻璃化法超低温保存园艺植物茎尖技术
• 3.1 玻璃化法保存植物材料的原理
• 3.2 茎尖培养时期的选择
• 3.3 预培养
• 3.4 预处理
• 3.5 冰冻保护剂的选择
• 3.6 解冻和洗涤
• 3.7 茎尖的再培养及保存效果的评价
• 4 体细胞无性系变异的研究
• 4.1 体细胞无性系变异的来源及其产生机理
• 4.2 体细胞无性系变异的影响因素
• 4.2.1 所用材料
• 4.2.2 离体培养时间
• 4.2.3 生长调节物质
• 4.3 再生植株遗传变异的检测方法
• 4.3.1 形态学标记
• 4.3.2 细胞学标记
• 4.3.3 分子标记
• 5 SRAP标记技术
• 5.1 SRAP标记的原理
• 5.2 SRAP标记的技术流程
• 5.2.1 SRAP-PCR扩增
• 5.2.2 产物的凝胶电泳分析
• 5.3 SRAP标记的应用
• 5.3.1 遗传多样性分析
• 5.3.2 遗传图谱的构建
• 5.3.3 比较基因组学
• 5.3.4 重要性状的标记
• 6 本研究的目的和意义
• 第二章 玻璃化法保存马铃薯茎尖体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验仪器和试剂
• 1.3 试验设计
• 1.4 试验基本操作过程
• 1.5 试验方法
• 1.5.1 试管苗的培养时间
• 1.5.2 茎尖的预培养
• 1.5.3 茎尖的预处理
• 1.5.4 茎尖的处理
• 1.5.5 不同玻璃化保护剂处理
• 1.5.6 不同洗涤条件的处理
• 1.5.7 不同恢复培养基的处理
• 1.5.8 冻后茎尖成活率和再生率的统计
• 2 结果与分析
• 2.1 试管苗的培养时间对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 2.2 不同浓度的蔗糖（或DMSO）预培养对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 2.3 60%PVS2预处理时间对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 2.4 PVS2处理时间对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 2.5 不同玻璃化保护剂对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 2.6 不同洗涤条件对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 2.7 不同恢复培养基对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 2.8 不同超低温保存体系对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 3 讨论
• 3.1 预培养对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 3.2 冰冻保护剂对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 3.3 解冻和洗涤方式对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 3.4 恢复培养基及培养条件对解冻后茎尖成活率和再生率的影响
• 3.5 材料培养再生及其形态发生
• 3.6 影响超低温保存后茎尖成活率和再生率提高的因素
• 4 小结
• 第三章 再生植株遗传稳定性的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验仪器和试剂
• 1.3 试验方法
• 1.3.1 CTAB法提取幼苗基因组DNA
• 1.3.2 基因组DNA质量的检测
• 1.3.3 SRAP-PCR反应体系的优化
• 1.3.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法
• 1.3.5 引物的筛选
• 1.3.6 数据的处理
• 2 结果与分析
• 2.1 CTAB法提取幼苗基因组DNA的质量
• 2.2 SRAP-PCR反应体系
• 2.3 引物筛选
• 2.4 再生植株遗传稳定性的分析
• 3 讨论
• 3.1 基因组DNA的质量
• 3.2 SRAP-PCR反应体系
• 3.3 再生植株的遗传稳定性
• 第四章 全文结论
• 1 建立了适合大西洋茎尖玻璃化法超低温保存的体系
• 2 CTAB微量提取幼苗DNA的方法适合SRAP分析
• 3 初步对超低温保存后再生植株的遗传稳定性进行了研究
• 参考文献
• 附录1
• 附录2
• 附录3
• 致谢
• 作者简介